骨肉瘤干細胞及其多藥耐藥性的體內(nèi)外相關研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨肉瘤是人類最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，易發(fā)生早期轉移，有較高的致死和致殘率。目前對于骨肉瘤的治療一般采取化療聯(lián)合手術切除的綜合療法，但是隨著治療時間的增加，多藥耐藥骨肉瘤細胞的出現(xiàn)極大的影響了新輔助化療的效果，使骨肉瘤患者的5年生存率徘徊在58％-70％左右，很難再進一步提高，成為骨肉瘤治療過程中的主要的障礙和難題。所以研究骨肉瘤多藥耐藥的發(fā)生機制，尋找逆轉耐藥的方法成為目前骨肉瘤治療過程中

2、急需解決的問題。
　　 研究骨肉瘤多藥耐藥的機制首先要在體內(nèi)外建立骨肉瘤多藥耐藥的模型。耐藥模型的建立的方法一般有兩種:成熟細胞系誘導或者耐藥骨肉瘤細胞原代培養(yǎng)。其中前者更具有穩(wěn)定性、代表性和說服力。SaOS-2、U2OS是研究常用的人骨肉瘤細胞系，但由于其體內(nèi)致瘤率低而不利于體內(nèi)實驗的進行，因此我們還選取了具有較高致瘤性的MNNG/HOS人骨肉瘤細胞系，通過化療藥物誘導建立此三種細胞系的骨肉瘤多藥耐藥細胞模型，這在國內(nèi)外尚屬首

3、例。
　　 骨肉瘤干細胞是骨肉瘤中一小群具有自我更新和分化功能的細胞。通常這部分細胞處于靜止期，當受到刺激或者周圍微環(huán)境改變時，它就會不斷增殖分化成異質性的腫瘤細胞。骨肉瘤干細胞具有無限增殖、多藥耐藥和高致瘤性等特點，常規(guī)治療方法很難將其殺滅，所以它們被看做是骨肉瘤耐藥、復發(fā)和轉移的罪魁禍首。
　　 研究表明，骨肉瘤干細胞可表達特殊的表面標志，例如CD133、CD105和Stro-1等。目前對于骨肉瘤干細胞的表面標記的研

4、究尚處于起步階段，存在較多的爭論，但是比較公認的觀點是根據(jù)細胞表面標志不同而分離出的干細胞均處于決定腫瘤細胞分化方向的重要階段，它們對腫瘤的生長、侵襲、耐藥、復發(fā)起著決定作用。因此進一步研究和發(fā)現(xiàn)骨肉瘤干細胞的表面標志，對于研究腫瘤干細胞的形成機制和耐藥機制具有重大意義。低親和力神經(jīng)生長因子受體CD271，是骨髓間充質干細胞的表面標記，近來研究發(fā)現(xiàn)它也是黑色素瘤和乳腺癌的干細胞標記，而骨肉瘤干細胞與CD271的關系目前國內(nèi)外尚未見研究報

5、道。
　　 腫瘤多藥耐藥機制復雜多樣，與ABC轉運蛋白、TOPOⅡ、癌基因Bcl-2、P53、NF-κB等因素有關。其中MDR1(P-gp)被認為是包括骨肉瘤在內(nèi)多種腫瘤發(fā)生多藥耐藥的主要原因，它能將化療藥物逆濃度梯度排出在細胞外，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。研究骨肉瘤耐藥細胞系腫瘤干細胞中MDR1(P-gp)的表達和功能有助于闡明骨肉瘤的耐藥機制，為尋找逆轉耐藥提供新方法。
　　 逆轉腫瘤多藥耐藥是所有耐藥研究

6、的根本目的，逆轉骨肉瘤多藥耐藥也是目前研究的熱點。逆轉骨肉瘤多藥耐藥的方法包括化學藥物和中藥制劑逆轉、免疫抗體逆轉、基因干擾逆轉等。由于中藥活性成分逆轉作用可靠，毒副作用小，易于獲得，因此中藥活性成分對于骨肉瘤耐藥逆轉的作用及機制成為研究的熱點。姜黃素有幾百年的應用歷史，具有廣泛的抗腫瘤活性，在體外能夠逆轉L1210/Adr、SGC7901/VCR、KB-V1和U2OS/AMD等腫瘤細胞的多藥耐藥性。因此研究姜黃素逆轉骨肉瘤細胞多藥耐藥

7、的作用及其機制，可為骨肉瘤的治療尋僻新的途徑。
　　 第一部分:
　　 人類骨肉瘤多藥耐藥細胞系SaOS-2/MTX，U20S/MTX和MNNG/HOS/MTX的建立與驗證
　　 目的:
　　 1.誘導人類骨肉瘤耐藥細胞系SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX;
　　 2.驗證SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX的多藥耐藥性，形成穩(wěn)定的人類骨肉

8、瘤多藥耐藥細胞系，為后續(xù)研究骨肉瘤多藥耐藥機制奠定基礎。
　　 方法:
　　 1.以甲氨蝶呤(Amethopterin，MTX)為誘導劑，采用化療藥物沖擊并且逐步增加藥物濃度的方法，誘導人類骨肉瘤細胞系（SaOS-2，U2OS和MNNG/HOS），并建立耐甲氨喋呤的人骨肉瘤細胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX);
　　 2.利用光學顯微鏡觀察細胞一般形態(tài)的變化，以培養(yǎng)天數(shù)為橫軸

9、、細胞數(shù)量為縱軸繪制生長曲線，比較耐藥細胞系與其母代細胞系在形態(tài)和增殖能力上的變化;
　　 3.MTT法分別檢測耐藥細胞株(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)對MTX、阿霉素(Doxorubicin，ADM)、表柔比星(Epirubicine，EPI)、順鉑(Cisplatin，DDP)和異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide，IFO)的藥物敏感性:計算其半數(shù)抑制濃度(halfmaximalinhibi

10、toryconcentration,IC50)和耐藥指數(shù)(resistanceindex，RI)，觀察各耐藥細胞系對骨肉瘤常見化療藥物的耐藥性;
　　 4.利用Real-timePCR和Westernblot技術分析骨肉瘤細胞耐藥前后MDR1基因表達的變化。
　　 結果:
　　 1.經(jīng)過6個月的誘導，建立人骨肉瘤耐MTX細胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)，耐藥細胞系能在含有

11、2000ng/mlMTX的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長、增殖、傳代;
　　 2.顯微鏡下觀察SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX細胞，細胞系表現(xiàn)出與母代細胞系相似的特征，但部分細胞體積增大，多形細胞、多核和巨核細胞增多;細胞生長曲線顯示耐藥細胞系生長曲線較母代細胞系平緩，增殖速度減慢;
　　 3.MTT法檢測結果表明，耐藥細胞針對各化療藥物的IC50(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HO

12、S/MTX)值與非耐藥細胞IC50(SaOS-2，U2OS和MNNG/HOS)相比在統(tǒng)計學上均有顯著差異(P＜0.05)。觀察各藥物耐藥指數(shù)，SaOS-2/MTX對MTX為高度耐藥，對ADM、EPI為中度耐藥，對DDP、IFO為輕度耐藥;U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX對MTX和ADM為中度耐藥，對EPI、DDP和IFO為低度耐藥;
　　 4.Real-timePCR和Westernblot結果顯示耐藥細胞系(SaOS

13、-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)中多藥耐藥基因(Multipledrugresistance1，MDR1)的表達比非耐藥細胞明顯增多(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.通過MTX沖擊誘導的人類骨肉瘤耐藥細胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)具有多藥耐藥的特性，對MTX、ADM、EPI、DDP、IFO均有不同程度耐藥，并能穩(wěn)定培養(yǎng)傳代能夠滿足后續(xù)試驗需要

14、;
　　 2.耐藥細胞系基本保持了與母代細胞系相似的特性，但是部分細胞形態(tài)略有改變，增殖變慢;
　　 3.骨肉瘤的多藥耐藥與MDR1的表達有密切的關系，MDR1過表達可能是骨肉瘤多藥耐藥的主要原因之一。
　　 第二部分:
　　 CD133+或CD271+骨肉瘤細胞介導骨肉瘤多藥耐藥的體內(nèi)外相關研究
　　 目的:
　　 1.鑒定骨肉瘤多藥耐藥細胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX，M

15、NNG/HOS/MTX)中腫瘤干細胞的存在;
　　 2.分析驗證CD133或CD271與骨肉瘤干細胞之間的關系;
　　 3.比較研究骨肉瘤耐藥細胞系和非耐藥細胞系中干細胞的變化，探討骨肉瘤干細胞在骨肉瘤多藥耐藥中的作用和機制。
　　 方法:
　　 1.利用免疫組化技術研究骨肉瘤患者臨床病理標本中CD271的表達情況;
　　 2.用骨肉瘤耐藥細胞系（SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/

16、HOS/MTX）和非耐藥細胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)制備細胞爬片，進行CD271的免疫組化染色，比較觀察二者之間CD271的表達變化;
　　 3.流式細胞儀檢測骨肉瘤細胞系SaOS-2、U2OS、HOS、SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271的表達比率，分析細胞耐藥前后CD133或CD271表達變化;
　　 4.磁珠分選技術分別分選SaOS-2/MT

17、X、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性的細胞;
　　 5.將各耐藥細胞系CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細胞分別種入低吸附六孔板中進行無血清培養(yǎng)，觀察細胞的單克隆成球率;
　　 6.Real-timePCR和Westernblot分別檢測耐藥細胞系中CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細胞中MDR1、Nanog和OCT4基因的的表達差異;
　　 7.體內(nèi)實驗檢測

18、骨肉瘤干細胞致瘤性:將各骨肉瘤耐藥細胞系中CD133陰性/陽性、CD271陰性/陽性細胞分別植入4周大小BALB/c裸鼠中（每組5只，共30只），觀察裸鼠的成瘤率。
　　 結果:
　　 1.不同類型的骨肉瘤標本中均有不同程度的CD271陽性細胞表達;
　　 2.細胞免疫組化結果顯示CD271在六種骨肉瘤細胞系中均有不同程度表達，其中耐藥細胞系(SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX)中的

19、表達高于非耐藥細胞系(SaOS-2、U2OS和MNNG/HOS)(P＜0.05);
　　 3.流式細胞儀分析顯示耐藥細胞系中CD133或CD271的表達比例明顯高于非耐藥細胞系，其中CD133和CD271的表達趨勢相似;
　　 4.磁珠分選成功從耐藥細胞系SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中分選出CD133陽性和CD271陽性細胞，無血清培養(yǎng)結果顯示CD133陽性或CD271陽性細胞的成球率

20、顯著高于陰性細胞;
　　 5.Real-timePCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)MDR1、Nanog和OCT4基因在CD133陽性和CD271陽性細胞中顯著表達(P＜0.05);
　　 6.體內(nèi)實驗顯示，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性的細胞在裸鼠體內(nèi)種植成瘤的幾率要明顯高于CD133或CD271陰性細胞，而SaOS-2/MTX細胞在裸鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有種植瘤生長的情況。
　

21、　 結論:
　　 1.CD271陽性細胞在骨肉瘤標本和細胞系中存在，其表達比例較CD133略高;
　　 2.CD133或CD271陽性骨肉瘤細胞能在無血清培養(yǎng)基中成球，在裸鼠體內(nèi)致瘤，具有干細胞的某些特性，CD271可能是骨肉瘤干細胞的一個新的表面標記;
　　 3.耐藥細胞系SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中腫瘤干細胞（CD133或CD271陽性）的比例增加，干細胞特征性基因(N

22、anog或OCT4)的表達也明顯升高，說明骨肉瘤干細胞參與了骨肉瘤多藥耐藥過程，并在其中可能發(fā)揮主要作用;
　　 4.骨肉瘤多藥耐藥的主要機制可能是骨肉瘤干細胞過表達MDR1(P-gp)引起的多化療藥物耐受。
　　 第三部分:
　　 姜黃素逆轉骨肉瘤干細胞多藥耐藥的體內(nèi)外相關研究
　　 目的:
　　 1.體外實驗觀察姜黃素逆轉人骨肉瘤SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX

23、細胞多藥耐藥的作用;
　　 2.體內(nèi)實驗觀察姜黃素逆轉MNNG/HOS/MTX細胞系耐藥，增敏化療藥物的作用;
　　 3.探討姜黃素逆轉骨肉瘤多藥耐藥的相關作用機制;
　　 4.觀察在多藥耐藥逆轉過程中骨肉瘤干細胞的變化，進一步分析骨肉瘤多藥耐藥的根本機制和逆轉方法。
　　 方法:
　　 1.通過MTT法檢測姜黃素對骨肉瘤耐藥細胞系(SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX

24、)的影響;
　　 2.選取30μM濃度的姜黃素進行逆轉骨肉瘤耐藥細胞系多藥耐藥的體外實驗，觀察其逆轉效果;
　　 3.流式細胞儀檢測姜黃素聯(lián)合MTX作用前后，骨肉瘤耐藥細胞系（SaOS-2/MTX、U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX）中腫瘤干細胞(CD133或CD271陽性)比例的變化;
　　 4.將SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX分別經(jīng)過0、10、20、30、40μM的姜

25、黃素刺激后，通過Real-timePCR和Westernblot檢測MDR1基因表達的變化;
　　 5.共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測姜黃素對SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX細胞內(nèi)羅丹明123（Rhodamine123，Rh123）積聚和外排的影響。
　　 6.體內(nèi)實驗:磁珠分選MNNG/HOS/MTX中CD133或CD271陽性細胞接種子20只BALB/c裸鼠中，一周后應用MTX（MTX組

26、）或姜黃素聯(lián)合MTX(Cur/MTX)進行干預，4周后處死老鼠觀察成瘤率、腫瘤體積大小，對種植瘤進行病理學檢查，并檢測種各組種植瘤中Nanog、OCT4和MDR1基因的表達變化。
　　 結果:
　　 1.30μM濃度以下的姜黃素對骨肉瘤多藥耐藥細胞影響較小;
　　 2.通過MTT法計算各化療藥物的IC50和RI顯示30μM姜黃素能不同程度逆轉SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX對各化療

27、藥物的耐藥性;
　　 3.姜黃素聯(lián)合MTX作用于耐藥細胞，能夠增敏化療藥物并殺傷骨肉瘤耐藥細胞系中的干細胞，降低其比例;
　　 4.Real-timePCR和Westernblot結果顯示，姜黃素能濃度依賴性的下調(diào)耐藥細胞株SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX中MDR1的表達;
　　 5.共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測顯示姜黃素能增加Rh123在SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和M

28、NNG/HOS/MTX細胞內(nèi)的聚集，抑制Rh123的外排，且呈濃度依賴關系;
　　 6.體內(nèi)試驗顯示，姜黃素能在體內(nèi)增加MTX的敏感性，降低腫瘤干細胞的成瘤率和下調(diào)Nanog、OCT4和MDR1基因的表達。
　　 結論:
　　 1.姜黃素在體外可有效逆轉骨肉瘤耐藥細胞系SaOS-2/MTX，U2OS/MTX和MNNG/HOS/MTX的多藥耐藥現(xiàn)象;
　　 2.姜黃素在體內(nèi)外能增敏化療藥物，殺傷骨肉瘤干細胞