草酸青霉孢子發(fā)生和纖維素酶基因表達共調控機制研究.pdf

1、木質纖維素是植物細胞壁的主要組分，是地球上數(shù)量最豐富的可再生性資源。使用生物法降解木質纖維素類可再生資源，轉化獲得各種生物燃料和化工產品，減緩石油等不可再生資源的消耗，對保護環(huán)境、促進全球經濟的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。利用微生物，特別是絲狀真菌所產纖維素酶，將天然木質纖維素高效地降解成為可發(fā)酵性糖是實現(xiàn)上述目標的核心關鍵。
　　草酸青霉是能夠分泌完全纖維素酶系的絲狀真菌，經過多輪誘變得到的高產菌株JU-A10-T已應用于工業(yè)生產

2、多年。研究草酸青霉纖維素酶調控機制，提高木質纖維素等可再生資源的有效利用，對促進人類經濟社會的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。然而，經過誘變篩選得到的纖維素酶高產菌株往往伴隨分生孢子形成能力的的大幅下降。因此，將絲狀真菌分生孢子產生和纖維素酶合成調控結合研究，將為進一步擴大高產菌株工業(yè)應用提供理論指導。
　　本論文的主要研究結果如下:
　　1.全局性調控因子LaeA調控孢子發(fā)生和纖維素酶表達的初步研究
　　LaeA是絲狀真菌中

3、高度保守的全局性調控因子，對初級代謝、次級代謝及無性發(fā)育均有重要的調控作用。
　　草酸青霉laeA基因缺失后，在以葡萄糖、乳糖、甘油和微晶纖維素為唯一碳源表型平板上產孢能力顯著下降，表明LaeA具有調控分生孢子產生的作用。雙敲菌株△laeA△creA，幾乎不產分生孢子，表明纖維素酶合成的全局性調控因子CreA同樣是分生孢子產生的關鍵調控因子。
　　LaeA敲除株在以微晶纖維素和麩皮為碳源培養(yǎng)時，在發(fā)酵前期，纖維素酶降解活力呈

4、上升趨勢，在發(fā)酵中后期，纖維素酶降解活力迅速下降，表明LaeA對纖維素酶的合成具有復雜的調控作用。主要纖維素酶基因轉錄水平表達量與酶活曲線一致，顯示LaeA對纖維素酶合成調控主要發(fā)生在轉錄水平。在laeA缺失菌株中進一步構建的雙敲菌株△laeA△creA、過表達菌株△laeA-PgpdA∷clrB和△laeA-PgpdA∷xlnR，酶活曲線與laeA單缺失菌株一致，發(fā)酵前期，纖維素酶降解活力呈上升趨勢，在發(fā)酵中后期，纖維素酶降解活力迅速

5、下降。結果表明，LaeA是草酸青霉纖維素酶基因表達合成后期所必需的。在草酸青霉野生型菌株114-2和高產突變株JU-A10-T中過表達laeA，發(fā)現(xiàn)纖維素酶酶活略有下降。
　　2.LaeA介導BrlA調控孢子發(fā)生和纖維素酶表達的功能研究
　　在草酸青霉laeA缺失菌株中，孢子發(fā)生關鍵調控因子brlA基因幾近沉默。BrlA的缺失阻礙了菌絲末端帚狀分支的形成，無分生孢子的生成，菌絲分支增加，菌落由綠色變?yōu)榘咨?br>　　Brl

6、A的缺失引起主要糖苷水解酶水平的上升，發(fā)酵第三天濾紙酶活比野生型提高了89.1％。胞外蛋白SDS-PAGE分析表明:brlA基因的缺失引起纖維素降解酶和淀粉酶蛋白的顯著表達，以及多種胞外蛋白表達的上調。熒光定量PCR的結果同樣支持了上述結果。序列分析發(fā)現(xiàn)纖維素酶基因啟動子區(qū)大多含有假定的BrlA結合位點，表明BrlA是纖維素酶表達的負轉錄調控因子。
　　由于多輪誘變后JU-A10-T基因組和轉錄組等發(fā)生很大變化，過表達BrlA在基