香煙提取物通過周期蛋白D1促進支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘）是當今世界最常見的慢性疾病之一，目前國、內(nèi)外的研究認為，哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氣道高反應性和氣道重構(gòu)。而氣道平滑肌的增殖在哮喘氣道重構(gòu)中起著重要作用，是不可逆性氣流阻塞、持續(xù)氣道高反應性的重要病理基礎(chǔ)。但是，哮喘氣道平滑肌增殖的調(diào)控機制目前尚不十分清楚。
　　 吸煙是影響哮喘發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素，它可以增加哮喘發(fā)生頻率和癥狀嚴重程度。目前研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可以降低皮

2、質(zhì)激素對哮喘患者的治療效果。香煙煙霧中含有6000多種化學物質(zhì)，其中多種物質(zhì)有毒。香煙煙霧能增加卵白蛋白致敏豚鼠氣道急性變應性炎癥。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，香煙提取物（CSE）可以促進哮喘大鼠氣道平滑肌細胞（ASMCs）的增殖，但其具體機制尚未闡明。
　　 國內(nèi)外研究表明,細胞分裂及細胞數(shù)量的增加要通過細胞周期，在細胞周期中必須有細胞周期蛋白的參與，這種蛋白對細胞周期起調(diào)控作用。而D1類細胞周期蛋白（cyclinD1）是調(diào)節(jié)細胞周期

3、G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子，參與眾多細胞周期的調(diào)控。CSE是否通過cyclinD1參與調(diào)控ASMCs增殖，目前相關(guān)研究報道尚少見。
　　 本實驗通過建立哮喘大鼠模型，體外培養(yǎng)ASMCs，在細胞水平研究CSE對ASMCs的增殖作用、對cyclinD1表達的影響以及PKC-cyclinD1信號通路是否參與CSE促ASMCs的增殖過程，探討CSE促進ASMCs增殖的可能機制。為進一步深入了解哮喘的發(fā)病機制，尋找有效的治療方法提供理論依

4、據(jù)。
　　 方法：
　　 1建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和細胞周期蛋白依賴激酶-4抑制劑GW8510干預哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細胞術(shù)及增殖細胞核抗原（PCNA）免疫細胞化學技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測細胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達。研究CSE對ASMCs的增殖作用以及對cycli

5、nD1表達的影響。
　　 2建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和cyclinD1反義表達質(zhì)粒干預哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細胞術(shù)及增殖細胞核抗原（PCNA）免疫細胞化學技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測細胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達。研究CSE和cyclinD1反義表達質(zhì)粒對ASMCs增殖的干預作用。<

6、br>　　 3建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和PKC激動劑PMA以及抑制劑Ro-31-8220干預哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細胞術(shù)及增殖細胞核抗原（PCNA）免疫細胞化學技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測cyclinD1和PKC-α的表達。探討PKC-cyclinD1信號通路是否參與CSE促ASMCs的增殖。

7、　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組ASMCs相比，CSE處理組G0/G1期細胞所占比例明顯減少，S+G2M期細胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達明顯增加。哮喘組與對照組相比，G0/G1期細胞所占比例明顯減少，S+G2M期細胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達明顯增加。經(jīng)GW8510干預后，哮喘組ASMCs

8、 G0/G1期細胞所占比例明顯增高，S+G2M期細胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達明顯減少。
　　 2. 反義質(zhì)粒組與對照組相比，G0/G1期細胞所占比例明顯增高，S+G2M期細胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達明顯減少。CSE組與CSE+反義質(zhì)粒組相比其G0/G1期細胞所占比例明顯減少，S+G2M期

9、細胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達明顯增加。
　　 3.與CSE組相比，Ro-31-8220處理組G0/G1期細胞所占比例明顯增高，S+G2M期細胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯降低。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表達明顯減少。CSE+PMA組和CSE+PMA+反義質(zhì)粒組相比其G0/G1期G0/G1期細胞所占比例明顯減少，S+G

10、2M期細胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達率明顯增高。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表達明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1. 哮喘大鼠ASMCs增殖活性明顯增強，CSE可以促進哮喘大鼠ASMCs增殖，cyclinD及其亞型cyclinD1在哮喘大鼠ASMCs的增殖中發(fā)揮了重要的作用。
　　 2. cyclinD1反義表達質(zhì)?？梢砸种葡笫驛SMCs的增殖，即使再用CSE刺激，也不能明