microRNA-146a通過Smad4調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是多種慢性致病因素作用于肝臟引起細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)過量沉積的創(chuàng)傷愈合過程。肝星狀細胞(hepatic stellates cell,HSC)的活化在肝纖維化發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用,激活的HSC是產(chǎn)生ECM的主要來源細胞。TGF-β1被認為是主要的致HSC活化的細胞因子。近年來研究顯示microRNA(miRNA)廣泛參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分

2、化、凋亡等一系列重要生物學進程。miR-146a是第一個被發(fā)現(xiàn)與免疫功能相關(guān)的miRNA,miR-146a是否參與調(diào)控TGF-β1誘導的HSC的活化目前還未見文獻報道。本研究觀察miR-146a在HSC活化過程中和肝纖維化形成過程中的表達變化,并深入探討其對HSC活化增殖的影響及其作用的分子機制,以揭示干預HSC活化的新的作用靶點。
　　實驗采用CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型,正常組10只、CCl4處理組15只。自處理之日開

3、始,除正常組,其他各組雄性大鼠皮下注射50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次,共12周;正常組給予同樣劑量花生油皮下注射。12周末,取肝組織進行病理組織學和Masson膠原染色檢測,并檢測α-SMA在大鼠肝組織中的表達變化。通過一步法實時定量PCR檢測不同濃度TGF-β1刺激的HSC和CCl4誘導的肝纖維化組織中miR-146a的表達。通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-146amimics(模擬物)到

4、大鼠肝星狀細胞株HSC-T6內(nèi)以觀察對TGF-β1誘導的HSC-T6增殖的影響,熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉(zhuǎn)染效率。體外培養(yǎng)的HSC,轉(zhuǎn)染60nMmiR-146amimics進入細胞,6h后用TGF-β110ng/ml刺激細胞24h或48h后,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法,細胞周期分析方法以及流式細胞術(shù)技術(shù)觀察miR-146a對TGF-β1誘導的HSC的增殖的影響。應用生物信息方法發(fā)現(xiàn)Smad4是miR-146a的潛在靶點。利用RT-P

5、CR,real-timeqPCR和westernblots,分別檢測TGF-β1誘導的HSC中活化的標志物α-SMA和Smad4mRNA及蛋白水平的表達。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)用不同濃度(0,5,10,15ng/ml)TGF-β1刺激HSC,miR-146a的表達呈劑量依賴性的下調(diào)。miR-146a在CCl4誘導的肝纖維化組織中表達也是下調(diào)的。與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染60nM的miR-146a模擬物進入HSC可以明顯減少TGF-β1誘導的

6、α-SMA的表達。過表達miR-146a可以顯著抑制TGF-β1誘導的HSC的增殖,增加細胞凋亡。生物信息技術(shù)顯示Smad4是miR-146a的潛在靶點。在TGF-β1刺激的HSC中,miR-146a可以顯著降低Smad4蛋白水平的表達,而不能降低其mRNA水平的表達,提示miR-146a是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Smad4的表達。以上研究表明,miR-146a通過轉(zhuǎn)錄后抑制Smad4的表達參與調(diào)控TGF-β1誘導的HSC的增殖,這可能成為肝纖