BRD7與AP3δ蛋白的交互作用及溴區(qū)結構域對BRD7功能影響的初步研究.pdf

1、Bromodomain是一進化上高度保守的功能域，存在于許多轉錄調控相關的蛋白質中。我們實驗室在1997年運用cDNA代表性差異分析法克隆了一個在鼻咽癌活檢組織中表達下調的新的bromodomain基因BRD7。功能研究表明BRD7可能參與了基因轉錄調控，是一個潛在的核轉錄調節(jié)因子。進一步的研究發(fā)現BRD7可能是通過Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條通路影響細胞周期的進程，使細胞停滯于G0/G1期。對BRD7在鼻咽癌中的研究表明，

2、BRD7的過表達可抑制鼻咽癌細胞的生長和細胞周期的進程。通過酵母雙雜交技術從人胎腦的cDNA文庫中篩選出6個與BRD7存在交互作用的蛋白：接頭相關蛋白復合物3δ亞單位(adaptor-relatedproteincomplex3δ，AP3δ)蛋白，BRD2蛋白、BRD3蛋白、β-IkB激酶、KIAA1375蛋白和IL-7蛋白。其中BRD2蛋白、BRD3蛋白與BRD7蛋白的交互作用已經通過免疫共沉淀技術得到了進一步的證實，同時發(fā)現BRD7

3、可能影響B(tài)RD2、BRD3在mRNA上的表達水平，它們在功能上密切關聯(lián)，可能共同參與了鼻咽癌的發(fā)病過程。 本研究首先考察了BRD7的亞細胞定位以及bromodomain結構域對BRD7亞細胞定位的影響，并初步探討了bromodomain結構域對BRD7轉錄調節(jié)功能的影響。 我們構建了bromodomain缺失型的BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd,利用GFP介導的亞細胞定

4、位方法和Myc靶介導的間接免疫熒光方法，觀察到BRD7在COS7細胞中主要定位在細胞核，與染色質的分布存在一定程度的相似性；而bromodomain結構域的缺失并不影響B(tài)RD7的細胞核分布，但是其在核內的分布模式發(fā)生了一定的改變。同時通過熒光素酶報告基因分析法檢測到無論是野生型BRD7還是缺失bromodomain結構域的BRD7突變體均能夠使Wnt通路末端分子TCF的啟動子活性下調，并且下調的程度沒有明顯差別。說明bromodomai

5、n結構域對于BRD7對Wnt通路的調節(jié)作用并沒有顯著影響。 大量文獻顯示，如果兩種蛋白存在交互作用，那么它們在功能上也密切關聯(lián)，共同參與某一信號轉導通路或疾病發(fā)病過程。為此本研究在我室前期的工作基礎上，進一步證實了BRD7蛋白與AP3δ蛋白的交互作用，并對兩者功能上的關聯(lián)進行了初步的研究。 首先我們使用細胞熒光共定位技術觀察到BRD7和AP3δ蛋白共同定位于細胞核，并通過免疫共沉淀直接證實了兩者的交互作用，同時我們觀察到

6、溴區(qū)結構域對BRD7和AP3δ的細胞同定位沒有明顯的影響。然后利用半定量逆轉錄PCR(semi-quantityRT-PCR)技術檢測到在鼻咽癌HNE1細胞中，隨著BRD7表達水平的上調，AP3δ基因的表達也有明顯增強，提示BRD7能夠促進鼻咽癌細胞中AP3δ基因的表達。同時通過熒光素酶報告基因分析法檢測了BRD7及AP3δ對Rb/E2F信號轉導通路中的兩個關鍵分子E2F3和CyclinDl啟動子活性的影響。發(fā)現BRD7單獨作用可以使這