基于調控肺泡上皮細胞介導炎癥反應的補肺益腎方“譜-效”相關性研究.pdf

1、　　補肺益腎方由人參、淫羊藿、赤芍、陳皮、枸杞子等十二味中藥組成,具有補益肺腎、納氣平喘、化痰止咳的功效,是中醫(yī)治療慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)穩(wěn)定期肺腎氣虛證的有效藥物,可減輕炎癥反應和粘液分泌,減少對氣道壁的損傷,減輕氣道阻塞,從而降低對肺組織的損傷,延緩肺功能的下降。中藥指紋圖譜-藥效學(譜-效)相關性研究是將中藥指紋圖譜中標示活性成分的特征峰數(shù)據(jù)與藥效結

2、果對應起來,將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效聯(lián)系起來的研究方法,是開展中藥藥效物質基礎研究的重要模式。因此,開展補肺益腎方的譜-效相關性研究,是揭示該復方藥效物質基礎并明確其作用機制的有效途徑。
　　目的：
　　以補肺益腎方為研究對象,優(yōu)選該方藥的提取工藝；建立補肺益腎方全方、拆方的HPLC指紋圖譜；分別以香煙煙霧提取物(Colombo Stock Exchange,CSE)和脂多糖(Lip Polysacc

3、haride,LPS)刺激肺泡上皮細胞株A549細胞為研究模型,進行藥效學實驗,闡釋補肺益腎方及其拆方調控A549細胞炎癥反應的效應及其特征；對得到的指紋圖譜特征峰信息和藥效指標數(shù)據(jù)進行相關性計算,闡明指紋圖譜數(shù)據(jù)與藥效特證信息的相關性,為揭示補肺益腎方的藥效物質基礎及作用機制提供依據(jù)。
　　方法：
　　1 對補肺益腎方中人參、枸杞子等藥材用水提醇沉法提取,采用L9(34)正交設計實驗,以人參皂苷Rg1、Re、Rb1

4、的總含量為指標,考察加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)及醇沉濃度對提取工藝的影響；對方中淫羊藿、赤芍等藥材用乙醇回流提取,采用L9(34)正交試驗法,以淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷含量為指標,考察乙醇濃度、乙醇用量、回流時間和回流次數(shù)對醇提工藝的影響,優(yōu)化提取條件。
　　2 對補肺益腎方進行拆方,通過篩選高效液相色譜條件,根據(jù)化學指紋圖譜研究的要求,運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件,建立補肺益腎方及其拆方的HPLC指紋圖譜,并對各色

5、譜峰進行歸屬,找出藥材來源及所代表的化學成分。
　　3 分別以 CSE 和 LPS 刺激 A549 細胞,MTT 法篩選出最佳的刺激濃度后, A549細胞按孔平均分為正常組(20%正常大鼠血清)、刺激組(20%正常大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)、用藥組(20%補肺益腎各拆方組大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)安排實驗,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immuno Sorbent

6、Assay,ELISA)法檢測A549細胞對粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL-3、IL-8、IL-1β)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-9 及其抑制物-1 (MMP-9 和 TIMP-1)、酶磷脂酸脂肪酶 2B (PPAP2B)、脂肪酸轉位酶(CD36)、超氧化物歧化酶(SOD)的分泌及變化情況。
　　4 采用雙變量相關分析方法,將補肺益腎方各拆方組HP

7、LC指紋圖譜的峰面積進行量化,與ELISA法測得的各拆方組血清干預A549細胞炎癥因子的結果相結合,計算pearson相關系數(shù),并對相關性進行分析,構建補肺益腎方“化學譜”–“藥效”關系。
　　結果：
　　1 補肺益腎方最佳提取工藝為：人參等藥材采用水煎煮提取,加 12倍量水,煎煮2次,每次60 min,濃縮液加95%乙醇至含醇量為70%,靜置12 h,取上清液回收乙醇,濃縮；淫羊藿等藥材采用乙醇回流提取,加 8 倍

8、量的 60% 乙醇溶液,回流兩次,每次 60 min,回收乙醇,濃縮；合并水提和醇提濃縮液,減壓干燥。
　　2 補肺益腎方HPLC指紋圖譜研究表明：十批樣品指紋圖譜間的相似度均達到0.90以上,全方確定了71個共有峰,其中指認出熊果酸、巖白菜素、馬錢苷、芍藥苷、淫羊藿苷、五味子甲素、五味子乙素、人參皂苷、貝母素甲、貝母素乙等二十個成分,并對各色譜峰的藥材來源進行了歸屬。
　　3 ELISA 結果顯示：與正常組比較,A

9、549 細胞 CSE 組 MMP-9 濃度升高(P<0.05),IL-3、IL-8(P<0.05)和TGF-β(P<0.01)濃度降低；LPS組TIMP-1濃度升高(P<0.05),IL-3、TGF-β 濃度降低(P<0.01)。補肺益腎各拆方組均可糾正 CSE 對 A549 細胞分泌 IL-1β、TGF-β、PPAP2B、CD36 和 LPS 對細胞分泌 IL-3、SOD的影響；除第11組全方外,其它各拆方組均可以糾正CSE對A549

10、細胞分泌TNF-α和LPS對細胞分泌TNF-α、TGF-β的影響。
　　4 譜-效相關性研究表明：補肺益腎方指紋圖譜中 43、55 號峰(淫羊藿)、66號峰(五味子)、28、47號峰(陳皮)、27號峰(矮地茶)、9、15、24號峰(赤芍)等成分,對矯正 CSE刺激下 A549細胞分泌 GM-CSF、IL-3、MMP-9、PPAP2B等因子的含量改變有顯著的相關性；但指紋圖譜中的10號峰(枸杞子)、8號峰(矮地茶)、31號峰(陳

11、皮)、5號峰(山茱萸)等成分,對矯正CSE刺激下 A549 細胞分泌因子的改變作用較小或呈相反的相關性。補肺益腎方指紋圖譜中28、47號峰(陳皮)、6、29號峰(矮地茶)、52號峰(人參)、68號峰(五味子)等,對矯正 LPS 刺激下 A549 細胞分泌 TNF-α、MMP-9、SOD、CD36 等
　　因子的濃度變化有顯著的相關性；但指紋圖譜中的5號峰(山茱萸)、9號峰(赤芍)、70 號峰(浙貝母)、60 號峰(陳皮)等成分

12、,對矯正 LPS 刺激下 A549細胞分泌因子的改變作用較小或呈相反的相關性。
　　結論：
　　1 正交試驗優(yōu)選出的補肺益腎方提取工藝穩(wěn)定、高效、簡便易行,為后期新藥研發(fā)的制劑工藝奠定了基礎。
　　2 HPLC法建立了補肺益腎方及其拆方的指紋圖譜,并對其進行評價分析, 10批次樣品間指紋圖譜的相似度均大于0.90,全方共確定了71個共有峰,均找出了藥材來源,并指認出熊果酸、巖白菜素、馬錢苷、芍藥苷、淫羊藿苷

13、、五味子甲素、五味子乙素、人參皂苷、貝母素甲、貝母素乙等二十種化學成分,可以對復方藥材質量進行鑒別,以達到控制補肺益腎方品質和藥效的目的。這與傳統(tǒng)的以單一或某幾個化學成分對復方的質量進行控制的方式相比,更能很好地反映復方的質量。
　　3 CSE和LPS刺激對肺泡上皮細胞A549分泌細胞因子均有一定程度的影響,補肺益腎含藥血清對 CSE 和 LPS 刺激下細胞因子分泌量的改變有一定的調節(jié)作用,其中對CSE刺激下A549細胞分泌I

14、L-1β、TGF-β、CD36、MMP-9、PPAP2B和對LPS刺激下A549細胞分泌TIMP-1、IL-3、SOD的調節(jié)最為明顯。不同刺激物對細胞的因子的影響不同,同一刺激物下不同拆方組含藥血清對細胞因子的影響也不同,這為闡明補肺益腎方的作用機制奠定了基礎,也為尋找該復方的藥效物質基礎提供了思路。
　　4 譜-效相關性研究表明,補肺益腎方中人參、黃芪、淫羊藿、陳皮、赤芍等藥材中主要成分對矯正A549細胞炎癥因子的濃度變化有