歐亞旋覆花中黃酮類化合物的研究.pdf

1、中醫(yī)藥在人類疾病的預防和治療中占有重要地位。21 世紀以生命科學、信息科學和物質科學為先導的科學技術正在不斷地促進經(jīng)濟的繁榮和人類文化的變革。把它們的研究成果應用于中藥的二次開發(fā)，加強創(chuàng)新中藥的研究，將極大推動中藥現(xiàn)代化的進程。世界各國實踐早已證明，天然傳統(tǒng)藥物歷來就是創(chuàng)新藥物研究開發(fā)的重要源泉。在中國，結合干百年來傳統(tǒng)醫(yī)學的寶貴經(jīng)驗，從天然藥物出發(fā)研究開發(fā)創(chuàng)新藥物將被證明是一條捷徑，創(chuàng)新藥物的研究與中藥現(xiàn)代化工作結合起來，必將形成中國

2、特色。 歐亞旋覆花是一種傳統(tǒng)的中草藥，為菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花(Inula Britannica L.)的干燥頭狀花序，主要分布于我國、韓國和日本，我國主產(chǎn)于河南、河北、江蘇、浙江、新疆、東北等地。該藥收載于中華人民共和國藥典2005年版一部，性味咸、溫，入肺、腎經(jīng)，主治咳嗽消痰、脅下脹滿、大腹水腫、去頭目風、泄散風寒。目前，報道的歐亞旋覆花的化學成分約有四十多種，主要含有甾醇、倍半萜、香豆素及黃酮類化合物，具有抗炎、抗肝損

3、傷、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。國內對其研究報道較少，為了搞清國產(chǎn)歐亞旋覆花的化學成分，闡明其活性物質基礎，開拓其應用范圍，我們對歐亞旋覆花中黃酮類化合物進行了系統(tǒng)研究，希望從中發(fā)現(xiàn)作用強、副作用小的有效成分或以它為先導化合物，進行深入研究。并將總黃酮研制開發(fā)成新的現(xiàn)代中藥劑型。 本文首次建立了紫外分光光度法測定歐亞旋覆花中總黃酮含量的方法；并以總黃酮含量為指標，采用L<,9>(3)<'4>正交設計選取最佳提取、分離工藝，通過

4、靜態(tài)和動態(tài)試驗選擇最佳大孔吸附樹脂及純化工藝參數(shù)；同時研究了總黃酮生物活性。從歐亞旋覆花的95％乙醇提取物的醋酸乙酯和正丁醇部分中分離出化合物單體十二個，并運用波譜分析技術結合理化性質鑒定了結構；并以得到的單體成分為對照品，建立了 HPLC 法同時測定五種黃酮含量的分析方法，為進一步開發(fā)利用歐亞旋覆花藥材提供了物質基礎和實驗依據(jù)。 第一部分歐亞旋覆花中總黃酮的提取分離工藝及含量測定研究 第一節(jié)歐亞旋覆花中總黃酮提取分離工

5、藝的優(yōu)化 目的：研究歐亞旋覆花總黃酮的提取條件和用大孔吸附樹脂純化的工藝及其參數(shù)，為開發(fā)歐亞旋覆花這一古老藥用資源奠定實驗基礎。 方法：(1)歐亞旋覆花總黃酮提取工藝的研究。根據(jù)黃酮類化合物的性質，以總黃酮含量為指標，分別用80％、60％、30％乙醇和水為提取溶劑提取，選擇合適的提取溶劑；分別用超聲、回流和索氏提取三種提取方法進行提取，選擇最佳提取方法；采用正交試驗，以總黃酮含量為指標，考察提取次數(shù)、提取時間和溶劑用量等

6、關鍵因素，優(yōu)化工藝條件；按所確定的最佳提取工藝條件驗證試驗提取工藝的可行性。 (2)歐亞旋覆花總黃酮分離純化工藝的研究。按最佳提取工藝條件制備歐亞旋覆花粗提液，測定總黃酮的含量；取X-5、S-8、NKA、NKA-9、AB-8、D<,4020>、SP700 七種大孔吸附樹脂進行預處理，從總黃酮靜態(tài)平衡吸附量、靜態(tài)吸附動力學過程等方面，對七種大孔吸附樹脂進行研究。選擇一種最適宜分離歐亞旋覆花中總黃酮的樹脂型號；在選定型號的樹脂柱上，

7、通過動態(tài)吸附試驗確定分離歐亞旋覆花總黃酮的工藝參數(shù)。 (3)AB-8 大孔吸附樹脂法和聚酰胺柱層析法比較歐亞旋覆花總黃酮的純化工藝。耿相同量的樣品液2份，分別過聚酰胺柱和AB-8大孔吸附樹脂柱，水洗脫后，分別用95％和 70％乙醇洗脫，冷凍干燥，測定總黃酮的含量和回收率。 結果：正交試驗結果表明：提取歐亞旋覆花總黃酮的最佳工藝條件為用10倍量水，回流提取3次，每次1h。提取次數(shù)對提取工藝有顯著性影響，提取時間和加水量對提

8、取工藝沒有顯著性影響。驗證試驗結果與正交試驗結果一致。 從樹脂靜態(tài)平衡吸附量、吸附率、解吸率、吸附平衡速率常數(shù)、吸附動力學曲線等方面考察了X-5、S-8、NKA、NILA-9、AB-8、D<,4020>、SP700七種大孔吸附樹脂對歐亞旋覆花總黃酮的吸附性能。綜合各項指標，結果表明，SP700 型樹脂雖然對歐亞旋覆花總黃酮具有吸附容量大、易解吸、富集純度高等優(yōu)點，但系進口產(chǎn)品。國產(chǎn)AB-8 大孔吸附樹脂對黃酮的吸附、富集、分離也

9、有比較好的效果，且是大生產(chǎn)中的首選。因此，選定AB-8大孔吸附樹脂富集歐亞旋覆花總黃酮； 歐亞旋覆花總黃酮最佳純化工藝參數(shù)為：提取物上樣濃度0.2g/mL，以2mL/min的流速緩慢上樣，用70％乙醇進行洗脫，洗脫速度為3mL/min，樹脂重復利用4次。驗證實驗結果表明，該工藝穩(wěn)定可行。采用上述工藝，歐亞旋覆花樣品液中總黃酮量為10.9％；經(jīng)聚酰胺法純化后，總黃酮含量為78.2％，總黃酮回收率為49.9％；經(jīng) AB-8 吸附樹脂

10、純化后，總黃酮含量為89.5％，總黃酮回收率為92.8％。 結論：本文采用回流提取法，通過正交實驗設計優(yōu)化歐亞旋覆花總黃酮的提取工藝；首次用AB-8大孔吸附樹脂，考察歐亞旋覆花總黃酮純化工藝參數(shù)，確定了最佳分離純化工藝。驗證試驗表明，工藝穩(wěn)定，方法可行。用大孔吸附樹脂純化工藝制備得到的歐亞旋覆花總黃酮含量達到89.5％，為歐亞旋覆花中藥制劑研制奠定了較堅實的基礎。 第二節(jié)紫外分光光度法測定歐亞旋覆花總黃酮含量 目

11、的：建立歐亞旋覆花中總黃酮的含量測定方法，為歐亞旋覆花藥材的質量控制提供分析手段，為總黃酮提取、分離工藝的優(yōu)化提供指標分析方法。 方法：采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，水為提取溶劑，在510nm波長處，測定歐亞旋覆花中總黃酮的含量。 結果：總黃酮在10.3-51.5μg/mL 范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=12.2X-0.3×10<'-3>，r=0.9999(n=5)。方法回收率為99.1％，RSD為1.51％

12、(n=6)。山西、安國、江蘇、河南、甘肅、內蒙、新疆七個不同產(chǎn)地歐亞旋覆花中總黃酮的含量測定結果表明：江蘇產(chǎn)歐亞旋覆花中總黃酮含量最高，達8.79％；新疆產(chǎn)歐亞旋覆花中總黃酮含量較低，為6.28％。 結論：本文首次建立歐亞旋覆花中總黃酮的含量測定方法，并對七個不同產(chǎn)地的歐亞旋覆花的總黃酮的含量進行了測定。該方法操作簡便，結果準確，重復性好，適于歐亞旋覆花藥材的質量控制。 第二部分歐亞旋覆花中黃酮類單體化合物的分離及含量測

13、定 第一節(jié)歐亞旋覆花中黃酮類單體化合物的分離和純化 目的：采用系統(tǒng)分離法對歐亞旋覆花(InuIa Britannica L.)進行分離，取醋酸乙酯和正丁醇部位分離單體黃酮，用波譜法和對照品對照法確定單體化合物的結構，為進一步開發(fā)利用歐亞旋覆花提供物質基礎。 方法：取歐亞旋覆花加 95％乙醇回流提取，濃縮提取液得粗提物，粗提物分別用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取，得到不同極性的物質部位。采用硅膠、聚酰胺、sep

14、hadex LIt-20、大孔吸附樹脂柱層析，薄層制備等分離方法，從醋酸乙酯和正丁醇部位分離單體黃酮；采用薄層層析色譜、高效液相色譜和波譜分析(EI-MS，IR，H-NMR，C-NMR，H-HCOSY，DEPT，HMQC，HMBC)，鑒定所得單體的化學結構。 結論：通過對歐亞旋覆花的醋酸乙酯部分和正丁醇部分提取物的化學成分的系統(tǒng)分離，從中分離得到十二種化合物，其中五種為首次從該植物得到。 第二節(jié)高效液相色譜法同時測定歐亞

15、旋覆花中五種黃酮的含量 目的：建立同時測定歐亞旋覆花中五種黃酮(槲皮素、木犀草素、異鼠李素、菠葉素、6-甲氧基-木犀草素)含量的高效液相色譜法，為歐亞旋覆花藥材及其制劑的質量控制提供依據(jù)。 方法：采用反相高效液相色譜法，通過色譜條件的優(yōu)化，最后確定：色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫40℃，以甲醇-乙腈-0.49％枸櫞酸為流動相，采用梯度洗脫方式，流速1.0mL/min，檢測波長

16、為360nm，進樣量20μl。并在上述色譜條件下測定了七個不同產(chǎn)地的歐亞旋覆花中五種黃酮的含量。 結論：本文首次建立了反相高效液相色譜法同時測定歐亞旋覆花中五種黃酮含量的方法，并測定七個不同產(chǎn)地歐亞旋覆花中五種黃酮的含量。結果表明，建立的分析方法準確可靠，靈敏度高，為歐亞旋覆花的多指標質量控制提供了可靠的分析手段。 第三部分歐亞旋覆花中總黃酮的生物活性研究 第一節(jié)歐亞旋覆花總黃酮對血管平滑肌細胞的增殖和遷移的影響

17、 目的：探討歐亞旋覆花總黃酮對培養(yǎng)血管平滑肌細胞(VSMC) 增殖及遷移的影響。 方法：采用大鼠胸腹主動脈的動脈中膜平滑肌細胞，用貼塊法培養(yǎng)，實驗用4-7 代細胞，加入不同濃度的歐亞旋覆花總黃酮共同孵育24h。采用噻唑藍(MTT)法觀察該藥對細胞增殖的影響，倒置顯微鏡下觀察該藥對細胞遷移的影響。 結論：適宜濃度的歐亞旋覆花總黃酮可明顯抑制體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞的增殖、遷移。 第二節(jié)歐亞旋覆花總黃酮對

18、大鼠局灶性腦缺血．再灌注損傷的保護作用 目的：探討歐亞旋覆花總黃酮對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷所致血清中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性變化的影響。 方法：應用三種不同劑量的歐亞旋覆花總黃酮舌下靜脈給藥，采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，測定缺血2h再灌注4h后血清中MDA含量、SOD活性。 結論：歐亞旋覆花總黃酮對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷有保護作用，其腦保護機制可能與清除自由