東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組的測序分析及RON2在入侵中作用的研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是牛的巴貝斯蟲病中比較特殊的一個(gè)血液原蟲蟲種，其僅感染水牛的紅細(xì)胞，由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播。在我國長江以南多省份均有流行，患病動物常出現(xiàn)黃疸、高熱、貧血和血紅蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡，對我國的水牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)階段對于東方巴貝斯蟲的基因組信息所知有限，入侵相關(guān)機(jī)制的研究也鮮有報(bào)道。
　　基于此，本研究一方面克隆并注釋了東方巴貝斯蟲的頂質(zhì)體基因組DNA序列，并對其總

2、體的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了詳細(xì)的比對分析;另一方面，釣取了東方巴貝斯蟲棒狀體頸部蛋白2(RON2)基因信息，對RON2與AMA1的相互作用進(jìn)行了初步研究。
　　(1)B.orientalis頂質(zhì)體基因組的測序分析
　　對于頂質(zhì)體基因組，根據(jù)基因組測序的高通量測序序列和cDNA文庫釣取的部分頂質(zhì)體DNA序列，結(jié)合NCBI公布的頂復(fù)門血液原蟲頂質(zhì)體DNA序列，選擇其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體DNA全長。測序結(jié)果用軟件進(jìn)行拼接

3、，Artemis做注釋。結(jié)果表明，東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組全長33200bp的環(huán)狀分子，AT含量在78.9％，包含1個(gè)核糖體大亞基(LSU)、1個(gè)核糖體小亞基(SSU)，38個(gè)編碼蛋白的開放讀碼框以及24個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。其中38個(gè)ORF包括4個(gè)DNA依賴的RNA合成酶小亞基（rpoB、rpoC1、rpoC2a、rpoC2b）、17個(gè)核糖體蛋白、1個(gè)翻譯延長因子（tufA）、2個(gè)Clp分子伴侶基因以及14個(gè)大小功能未知的假定蛋白

4、。進(jìn)一步對所獲得的東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組DNA與NCBI上有報(bào)道的相關(guān)頂復(fù)門寄生蟲作了詳細(xì)的比對分析，綜合的結(jié)果表明東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組從基因組大小，基因種類，基因結(jié)構(gòu)，基因排列順序，基因進(jìn)化分析等一系列特征上都與牛巴貝斯蟲的頂質(zhì)體最為接近。
　　(2)棒狀體頸部蛋白RON2和AMA1基因的相互作用
　　根據(jù)NCBI上公布的頂復(fù)門寄生蟲的RON2序列及部分假定蛋白序列和東方巴貝斯蟲基因組測序獲得的部分序列，設(shè)計(jì)引物克隆

5、東方巴貝斯蟲棒狀體頸部蛋白2(RON2)基因，獲得的測序結(jié)果全長為4035bp，本研究選取了RON2與AMA1有相互作用的功能域進(jìn)行截短表達(dá)，分別設(shè)計(jì)特異性引物克隆BoRON2-2、BoRON2-5，構(gòu)建GST標(biāo)簽原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-RON2-2、pGEX-KG-RON2-5，高效表達(dá)。用純化后的RON2-2、RON2-5重組蛋白進(jìn)行Far-western實(shí)驗(yàn)，以及和AMA1蛋白的粘附ELISA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，重組表達(dá)的RON2