酸預處理對腦缺血的神經保護作用研究.pdf

1、缺血預處理作為近年來受到國內外學者廣泛關注的內源性保護策略，在各種離體及整體缺血再灌注模型中均被驗證了其神經保護作用，但是暫時性夾閉血管的手段使其難以在臨床上應用，所以尋找其他既具有神經保護作用，又能在臨床上容易實施的措施顯得格外重要。低糖、低氧以及組織酸化是缺血預處理的三個要素。有研究證明酸預處理能夠保護缺血引起的心肌細胞的損傷。然而，酸預處理是否能夠保護缺血性神經損傷目前尚不清楚。
　　目的：
　　研究酸預處理對腦缺血是

2、否存在神經保護作用；摸索酸預處理的較優(yōu)參數，包括pH值及酸預處理的時間窗；進一步深入分析酸預處理神經保護作用的可能機制。
　　方法：
　　1、采用20-25g雄性C57BL/6小鼠雙側頸總動脈結扎模型作為整體缺血再灌模型。在手術前，通過吸入5 min混合氣體(20％ CO2+21% O2+59% N2)，再吸入正常大氣10 min，如此重復3次，以降低腦內pH。通過被動回避的穿梭箱實驗檢測小鼠缺血后的行為學改變。隨后立即斷頭

3、取腦，制作冰凍切片，進行Niss1、TUNEL及DAPI染色，統(tǒng)計并分析海馬CA1區(qū)神經元個數。
　　2、采用小鼠皮層紋狀體腦片，隨機分為對照組(Control)、缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)組以及各酸預處理+OGD(APC)處理組。在OGD之前，將各APC組放入pH6.8的人工腦脊液(nACSF)中分別處理1、3、5 min，然后于正常腦脊液pH7.4中處理5 min、10 min、1

4、5 min。將除Control組以外的所有腦片進行20 min的OGD處理，再灌1h后收集腦片，檢測腦片損傷程度(TTC染色法)。選擇最優(yōu)參數后pH6.8、pH6.5和pH6.2(通過調節(jié)CO2)的APC組做相同處理從而選出最佳pH值。
　　3、采用17-18天胎鼠大腦皮層體外培養(yǎng)8-9 d的神經元，隨機分為Control組、OGD組以及各APC處理組。在OGD之前，將各APC組的培養(yǎng)液換為pH6.8的培養(yǎng)液，放入含20% CO2

5、的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 min、15 min、30 min后再次換成pH7.4的培養(yǎng)液，于5% CO2的培養(yǎng)箱中中培養(yǎng)0 min、30 min、60 min。將除Control組以外的進行2-h的OGD處理，再灌24 h后檢測神經元損傷程度(MTT染色法)。選出最優(yōu)參數再與Control組和OGD組通過TUNEL染色、Western blot檢測并分析其凋亡情況以及通過JC-1檢測其線粒體膜電勢的情況。并通過在APC組中加線粒體膜通透轉化

6、孔開放劑atractyloside，而后后檢測神經元損傷程度來分析酸預處理與線粒體膜通透轉化孔的關系。
　　結果：
　　1、酸預處理組小鼠的回避時間明顯長于手術組小鼠的回避時間。同時，酸預處理組小鼠海馬CA1區(qū)神經元的丟失情況也得到改善。
　　2、在腦片培養(yǎng)實驗上，pH6.8和pH6.5酸預處理均具有抗腦缺血的神經保護作用，但是pH6.2酸預處理不存在保護作用。給予3 min pH6.8+10 min pH7.4的酸預

7、處理明顯改善了OGD引起的損傷。
　　3、在體外神經元培養(yǎng)上同樣也發(fā)現了酸預處理對神經元的保護作用。給予15 min pH6.8+0-30 min pH7.4酸預處理明顯改善了OGD引起的神經元損傷。凋亡率由OGD組的49.2±6.3%減為APC組的21.7±4.8%。酸預處理可抑制OGD再灌誘導的神經元線粒體膜電勢的下降，并發(fā)現酸預處理的保護作用可以被線粒體膜通透轉化孔開放劑atractyloside所逆轉。
　　結論：<