鄂倫春馬cDNA文庫(kù)構(gòu)建及CCL2基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、鄂倫春馬是我國(guó)重要瀕危物種之一，現(xiàn)存數(shù)量極少、不足千匹，構(gòu)建鄂倫春馬的cDNA文庫(kù)對(duì)于鄂倫春馬遺傳資源的保護(hù)以及馬基因功能的研究具有重要意義。本研究構(gòu)建了鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫(kù)，成功從文庫(kù)中克隆了單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1，macrophagechemotacticprotein)基因，即CCL2基因，順利構(gòu)建了CCL2基因的原核和真核表達(dá)載體，并在體外培養(yǎng)蒙古馬成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)和亞細(xì)胞定位研究。 本研究取鄂倫春馬

2、耳緣組織，提取總RNA，運(yùn)用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建了鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫(kù)。所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)未擴(kuò)增文庫(kù)滴度為3.09x106pfu/ml，擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度為1.4x1010pfu/ml。從擴(kuò)增文庫(kù)中隨機(jī)挑取96個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明重組率為93.75％，插入片段平均大小為1.1kb。本研究的實(shí)施不僅對(duì)于馬基因結(jié)構(gòu)與功能研究具有重要意義。更重要的是對(duì)于鄂倫春馬基因資源的保存具有重要意義。 本研究取蒙古馬的耳緣組織

3、，通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功構(gòu)建了蒙古馬的成纖維細(xì)胞系，并對(duì)所建細(xì)胞系進(jìn)行了各項(xiàng)生物學(xué)特性檢測(cè)。結(jié)果表明，細(xì)胞系的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(AmericantypeCultureCollection，ATCC)細(xì)胞系鑒定標(biāo)準(zhǔn)，為研究外源基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控提供了優(yōu)質(zhì)的靶細(xì)胞。 本研究成功構(gòu)建了CCL2基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-CCL2。并設(shè)置IPTG的終濃度梯度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)pG

4、EX-4T-1-CCL2融合蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在36kD左右的位置出現(xiàn)CCL2融合蛋白的表達(dá)帶，但各實(shí)驗(yàn)組之間的差異不明顯，表明CCL2基因在BL21菌中表達(dá)成功，但誘導(dǎo)條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。 本研究利用構(gòu)建好的鄂倫春馬耳緣組織cDNA文庫(kù)為模板，成功克隆了CCL2基因，將CCL2基因完整的編碼區(qū)定向插入真核表達(dá)載體pEGFP-N3，pEYFP-N1和pDsRed1-N1的多克隆位點(diǎn)EcoRI和SalI之間，

5、成功構(gòu)建帶有熒光蛋白報(bào)告基因的真核重組表達(dá)載體pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將pEGFP-N3-CCL2、pEYFP-N1-CCL2和pDsRed1-N1-CCL2導(dǎo)入蒙古馬體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中。對(duì)CCL2基因的表達(dá)、亞細(xì)胞定位、陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖狀況以及細(xì)胞活力進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，各個(gè)重組融合蛋白的轉(zhuǎn)染率在11.1％～36.3％之