氧化應激中calpain對GSK-3β的片段化在其活性調節(jié)中的作用及機制.pdf

1、研究背景：糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種多功能的絲蘇氨酸蛋白激酶,其功能失調可導致多種疾病例如精神疾病、代謝系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展,而在此過程中,氧化應激也發(fā)揮重要作用。多條細胞信號通路參與調節(jié)GSK-3β的活性,酪氨酸216位點的磷酸化可以增加GSK-3β的活性,而其絲氨酸9位點的磷酸化則降低GSK-3β的活性,另外,胰島素途徑、wnt信號通路以及與GSK-3結合蛋白之間相互作用等都可調控GSK-3β的活

2、性。我們先前的實驗結果已報道過在氧化應激的情況下,GSK-3β活性增高,但是氧化應激是如何參與調節(jié)GSK-3β激酶活性的機制不明。已有研究報道,calpain對GSK-3βN端的片段化可導致GSK-3β的抑制結構域喪失,并將GSK-3β切割為兩個具有激酶活性的片段,即calpain的激活可截斷GSK-3β并使其活性升高。
　　目的：探討在HEK293/Tau441細胞系中,過氧化氫(H2O2)如何影響GSK-3β的活性及其潛在機制

3、,進一步研究氧化應激中calpain對GSK-3β的片段化在其活性調節(jié)中的作用及機制。
　　方法：細胞培養(yǎng),藥物處理后,用CCK-8試劑盒測定細胞活力,同時測定SOD和MDA含量,評估氧化應激模型是否成功建立,檢測GSK-3β活性,并運用westernblot技術檢測GSK-3β不同位點磷酸化程度以及可能參與磷酸化的相關激酶活性形式的表達;用I×71共聚焦顯微鏡檢測藥物處理后不同時間點熒光探針Fura-2-AM標記的HEK293/

4、Tau441細胞內鈣離子濃度變化,并運用蛋白免疫印跡分析GSK-3β的片段化程度;隨后又用上述實驗中所使用的過氧化氫濃度以及calpain的特異性抑制劑Ⅳ同時處理HEK293/Tau441細胞,探究calpain介導的GSK-3β特異性切割。
　　結果：(1)在過氧化氫處理的HEK293/Tau441細胞中,GSK-3β的活性與空白對照組相比增加了兩倍,然而GSK-3β的絲氨酸9位點的磷酸化程度也明顯升高,即非激活形式的GSK-3

5、β水平升高,同時GSK-3β的酪氨酸216位點的磷酸化程度未出現(xiàn)明顯改變;
　　(2)用過氧化氫處理HEK293/Tau441細胞1分鐘后,細胞內鈣離子濃度開始上升,3分鐘細胞內鈣離子濃度達到高峰,而后免疫印跡分析結果顯示GSK-3β被切割為兩個片段;
　　(3)用過氧化氫和calpain特異性抑制劑Ⅳ同時處理HEK293/Tau441細胞,發(fā)現(xiàn)GSK-3β的片段化效應明顯受到抑制。
　　結論：過氧化氫通過增加細胞鈣離