基于比較基因組學(xué)和mRNA高通量測序的可變剪接外顯子進化研究.pdf

1、可變剪接作為真核生物基因組中普遍存在的基因調(diào)控機制，與生物體的生長發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生都有著密切關(guān)系。在漫長的物種演化過程中，可變剪接以外顯子為基本單位不斷進化，其進化結(jié)果表現(xiàn)為可變剪接外顯子在不同物種中剪接方式、調(diào)控元件、表達量、對應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)功能等方面的差異?？勺兗艚油怙@子的出現(xiàn)與進化不但提高了基因組的使用效率，也成為生物體獲得新基因功能的重要途徑。因此，研究可變剪接外顯子的進化及其對基因調(diào)控、基因調(diào)控以及物種進化的影響就成為了分子

2、遺傳學(xué)與進化生物學(xué)中一個有趣的研究方向。
　　 近年來，隨著基因組計劃的大規(guī)模開展、比較基因組學(xué)研究方法的日趨成熟以及高通量測序技術(shù)在科研中的廣泛應(yīng)用，使得利用比較基因組學(xué)和高通量測序大規(guī)模的開展可變剪接外顯子進化研究成為可能。本文中，我們通過多種比較基因組學(xué)方法和人類、大鼠、小鼠多物種Solexa高通量測序、熒光定量PCR等實驗手段在不同水平上對可變剪接外顯子的進化規(guī)律和生物學(xué)意義進行了研究。
　　 首先，我們通過約1

3、00個自編perl程序腳本(12個核心程序詳見第二章方法部分)及多種生物信息學(xué)軟件首次構(gòu)建了可變剪接外顯子進化分析系統(tǒng)(Alternative Splicing Exon Evolution Analyzer，ASEEA)，ASEEA涵蓋了Ensembl數(shù)據(jù)庫中2萬多條人類基因、20多萬個外顯子，系統(tǒng)整合了外顯子進化選擇壓、蛋白結(jié)構(gòu)域、剪接調(diào)控元件、重復(fù)序列以及基于多物種Solexa測序的外顯子表達量等進化相關(guān)信息，為系統(tǒng)性研究可變剪接

4、外顯子進化規(guī)律提供了有力的分析工具。同時ASEEA也是首次使用高通量測序研究可變翦接外顯子的相對表達量，其中部分程序?qū)ζ渌诟咄繙y序的可變剪接研究也有一定參考價值。
　　 利用ASEEA，我們首次結(jié)合比較基因組學(xué)與mRNA高通量測序系統(tǒng)性總結(jié)了可變剪接外顯子的進化規(guī)律。分析結(jié)果顯示，可變剪接外顯子的保守性低于組成型外顯子，在可變剪接外顯子中，古老外顯子的進化選擇壓較大、表達量較高、重復(fù)序列包含率較低、與蛋白結(jié)構(gòu)域重合的比例也

5、較高，而年輕外顯子則正好相反。該趨勢體現(xiàn)了外顯子進化中‘序列-表達-功能’的一致性，反映了可變剪接外顯子從被引入轉(zhuǎn)錄本(exon recruiting)到獲得功能(gain-of-function)進而固定在轉(zhuǎn)錄本中(fixation)的過程，而在此過程中重復(fù)序列的插入和正選擇事件可能發(fā)揮了重要作用。我們還發(fā)現(xiàn)，可變剪接外顯子對基因功能獲得的貢獻度在進化中不斷上升。通過對比不同物種的Solexa數(shù)據(jù)我們觀察到直系同源外顯子表達量上存在明

6、顯的種問差異，提示可變剪接對高等生物的表型差異有重要貢獻，而可變剪接外顯子在物種進化中也存在相對表達量提高的趨勢。此外，我們還首次對非盒式可變剪接外顯子(特別是內(nèi)含子保留型可變剪接，intron retention)的部分進化規(guī)律進行了分析。
　　 其次，我們利用ASEEA對Memorial Sloan-Kettering Cancer Center腫瘤相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中的2006條腫瘤相關(guān)基因進行了可變剪接外顯子進化研究。結(jié)果顯

7、示腫瘤相關(guān)基因中可變剪接外顯子的進化符合可變剪接外顯子進化的一般規(guī)律。同時，我們首次報道了腫瘤相關(guān)基因外顯子在外顯子年齡、進化選擇壓、蛋白結(jié)構(gòu)域、剪接調(diào)控元件和表達量等方面的進化保守性傾向，說明腫瘤相關(guān)基因受到更嚴格的剪接調(diào)控，在引入新外顯子時更具選擇性。此外，我們還構(gòu)建了基于MySQL的腫瘤相關(guān)基因可變剪接外顯子進化數(shù)據(jù)庫(OncoAS)，并通過綜合數(shù)據(jù)檢索篩選出了部分可能發(fā)生重要進化事件的可變剪接外顯子。
　　 最后，根據(jù)O

8、ncoAS數(shù)據(jù)庫的提示，我們選取了VEGFA和PPAR-gamma進行進一步研究。在VEGFA的研究中，我們在小鼠、家兔中首次報道了包含可變剪接外顯子exon8b的抑制血管生成型VEGFA轉(zhuǎn)錄本，定量分析顯示該轉(zhuǎn)錄本相對表達量在進化中持續(xù)上升，exon8b經(jīng)歷了從低等哺乳動物中低相對表達量外顯子(minor form exon)到人類中高相對表達量外顯子(major form exon)的轉(zhuǎn)變并伴有剪接調(diào)控元件的強化。根據(jù)實驗結(jié)果我們提

9、出了VEGF基因調(diào)控機制形成的假說，提示exon8b與另一可變剪接外顯子exon6的引入都是基因調(diào)控機制形成的重要步驟，對蛋白產(chǎn)物的細胞定位與生理功能的發(fā)揮具有重要意義。在PPAR-gamma的研究中，我們發(fā)現(xiàn)該基因中的四個可變剪接外顯子處在從外顯子招募到獲得功能的不同進化階段，其中exonB作為唯一一個編碼的可變剪接外顯子仍處在快速進化中，其在嚙齒類中可能發(fā)生了正選擇事件并獲得了與脂肪貯存相關(guān)的功能。這些發(fā)現(xiàn)不僅在個體基因水平上進一步