重組腺病毒(Ad-GFP)感染胚胎大鼠神經(jīng)干細胞及耳蝸移植的實驗研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺病毒（AdGFP）感染胚胎大鼠神經(jīng)干細胞及耳蝸移植的實驗研究姓名：付勇申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉科指導(dǎo)教師：龔樹生20070501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文第二部分第二部分胚胎大鼠神經(jīng)干細胞的冷凍及復(fù)蘇胚胎大鼠神經(jīng)干細胞的冷凍及復(fù)蘇目的目的研究胚胎大鼠神經(jīng)干細胞（NeuralstemcellsNSCs）凍存復(fù)蘇后的成活率及再培養(yǎng)生長情況，觀察低溫凍存對NSCs生物特性的影響。方法

2、方法含有10%BSA及7.5%DMSO的NSCs無血清培養(yǎng)液(不含神經(jīng)生長因子)作為凍存液，將利用無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的原代、第三代、第六代胚胎大鼠NSCs進行凍存，于1周、4周、8周、12周、16分別復(fù)蘇，計數(shù)活細胞比例并進行再培養(yǎng)、分化鑒定。結(jié)果結(jié)果不同的細胞代數(shù)，不同的凍存時間對復(fù)蘇后的細胞存活率都無明顯影響。復(fù)蘇后NSCs的成活率均達到60％－70％，并能分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞。結(jié)論結(jié)論本實驗成功地對胚胎大鼠NSCs進行了凍

3、存復(fù)蘇及再培養(yǎng)，為擇期應(yīng)用NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細胞胚胎凍存復(fù)蘇第三部分第三部分攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒構(gòu)建及鑒定攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒構(gòu)建及鑒定目的目的構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒，為神經(jīng)干細胞（NeuralstemcellsNSCs）的基因轉(zhuǎn)染實驗提供條件。方法方法利用腺病毒細菌內(nèi)同源重組方法構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白（greenfluescentprotei

4、nGFP）基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdGFP，通過反復(fù)感染大量擴增病毒后，測定病毒的滴度，80℃保存?zhèn)溆?。結(jié)果結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切電泳證明重組成功；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞后，隨時間變化表達綠色熒光的細胞數(shù)目逐漸增多，熒光強度也逐漸增強；通過反復(fù)感染大量擴增病毒后，檢測病毒滴度約為5109PFUml。結(jié)論結(jié)論本試驗通過細菌內(nèi)同源重組方法，成功地構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（AdGFP）為下一步NSCs的體外基因感染研