體外多胺微環(huán)境對人肝癌細胞HepG2轉移的影響.pdf

1、實驗目的:
　　多胺是一種長鏈脂肪族化合物，天然多胺主要包括腐胺(putrescine，Put)、精胺(spermine，spm)和精脒（亞精胺）(spermidine，spd)。多胺廣泛存在于自然界，是大多數生命器官所必需的。生理性多胺在人體組織和體液中的含量非常少，而在腫瘤組織中多胺含量比正常組織中顯著增加且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關。本實驗通過外加多胺來模擬人體高、正常（中）和低三種不同多胺微環(huán)境對肝癌細胞生長、侵襲、

2、轉移等能力及相關分子機制的研究。
　　實驗方法:
　　選取人肝癌細胞HepG2作為研究對象，使用基因轉染技術把Akt3基因轉到HepG2細胞中。把外源性多胺按高多胺濃度(腐胺0.8 nmol/mL、精脒10.0 nmol/mL、精胺5.0nmol/mL);正常多胺濃度(腐胺0.08 nmol/mL、精脒1.0 nmol/mL、精胺0.5 nmol/mL);低多胺濃度(腐胺0.008 nmol/mL、精脒0.1 nmol/mL

3、、精胺0.05 nmol/mL)三組多胺分別加入含有相同培養(yǎng)基的HepG2細胞和HepG2-Akt3細胞中，培養(yǎng)15天和30天。每種細胞另設陰性對照。應用克隆形成能力實驗來檢測不同多胺濃度對兩種不同細胞增殖能力的影響;應用Transwell遷移實驗（未鋪膠）來檢測不同多胺濃度對兩種不同細胞遷移能力的影響;運用細胞劃痕實驗來檢測不同多胺濃度對兩種不同細胞傷口愈合能力的影響;運用蛋白免疫印跡實驗(Western blot)來分析不同多胺微環(huán)

4、境對與腫瘤細胞粘附遷移、侵襲等相關的各種蛋白表達的影響，如鳥氨酸脫羧酶(omithine decarbo-xylase，ODC)、精脒/精胺乙酰轉移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase，SSAT)、AKT、P27kip1、低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,

5、 VEGF)、鈣粘附蛋白(E-cadherin)、整合素(Integrinα6)、Akt3、組織蛋白酶D(Cathepsin D)等蛋白的變化。
　　實驗結果:
　　HepG2及HepG2-AKt3細胞在不同多胺微環(huán)境下顯示了不同的增殖、遷移、侵襲能力，而且隨著多胺濃度的升高其增殖、遷移、侵襲能力逐漸增強，并成時間劑量依賴性。HepG2-AKt3細胞在相同多胺濃度的情況下其增殖、遷移、侵襲能力比HepG2細胞顯著增強。蛋白免

6、疫印跡實驗結果表明多胺是通過誘導AKt3蛋白、低氧誘導因子(HIF1α)蛋白、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、精脒/精胺乙酰轉移酶(SSAT)、血管內皮生長因子(VEGF)、整合素(Integrinα6)、組織蛋白酶D(Cathepsin D)蛋白的上調以及P27kip1蛋白、上皮鈣粘附蛋白(E-cadherin)的下調等促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移。
　　實驗結論:
　　高多胺微環(huán)境能夠促進HepG2細胞和HepG2-Akt3細