早期激素性股骨頭壞死的氫氣干預研究及機制探討.pdf

1、研究背景：
　　股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)長期以來一直是骨科領域的一種難治性疾病，其發(fā)病機制至今尚未形成定論，多種病因均能引起股骨頭局部血運、細胞功能以及骨修復機制的障礙，從而導致ONFH，進而造成股骨頭塌陷、關節(jié)功能障礙。由于ONFH病程較長、早期病情比較隱匿容易被忽視，臨床上很大一部分患者就診時病情已經(jīng)是中晚期，此時最為可靠、確切、有效的治療方式只有人工關節(jié)置換，

2、但由于ONFH好發(fā)于30～50歲的中青年人群，人工關節(jié)置換的遠期療效尚不能令人滿意，而且目前人工關節(jié)置換價格不菲、不同術者的手術效果差異明顯、仍存在一些手術風險等，因此，如何在早期對ONFH進行干預治療，延緩、阻止甚至逆轉病情發(fā)展，最大限度的保留原股骨頭功能，避免人工關節(jié)置換成為很多研究者關注的熱點問題。
　　激素性ONFH是非創(chuàng)傷性ONFH中最為常見的一種類型，其發(fā)病機制較為復雜，目前認為氧化應激、細胞凋亡和內(nèi)皮細胞損傷在病情的

3、發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，多方面的病理機制共同作用，導致了股骨頭內(nèi)部骨代謝、骨重塑的異常，進而引起股骨頭塌陷和關節(jié)功能障礙。氫氣的選擇性抗氧化作用以及作為一種新型氣體信號轉導分子的可能性近年來得到廣泛研究。已有大量研究表明，氫氣能有效調(diào)節(jié)局部組織細胞的氧化應激水平、減少組織損傷、保護組織細胞，并有可能參與凋亡相關信號通路的調(diào)節(jié)。目前有關利用氫氣的生理學作用對激素性ONFH進行干預的研究尚未見報道。因此，本研究擬通過體外細胞實驗觀察氫氣對

4、成骨細胞、破骨細胞生長的影響，探討氫氣對骨組織細胞的可能作用機制;繼而在早期激素性ONFH動物模型中觀察氫氣吸入對骨壞死區(qū)域微結構的影響，檢測局部凋亡相關蛋白、細胞因子以及氧化應激相關分子的表達情況從而探討氫氣對早期激素性ONFH的作用機制，為探索一種簡單、有效的早期ONFH治療方法提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　第一部分早期激素性股骨頭壞死動物模型的誘導與評價
　　目的：通過激素聯(lián)合內(nèi)毒素（脂多糖）誘導建立兔早期ONFH模型

5、，運用影像學和組織學技術觀察并評價誘導ONFH的實驗效果。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔20只，隨機分為模型組14只和對照組6只，模型組動物經(jīng)耳緣靜脈注射脂多糖(8μg/kg)2次，后經(jīng)肌肉注射甲潑尼龍（20mg/kg）3次，對照組注射等量的生理鹽水，6周后行雙髖關節(jié)X線和MRI檢查，隨機處死模型組動物6只和全部對照組動物，取股骨頭標本后制備切片行組織學觀察，評估骨壞死表現(xiàn)，并計數(shù)兩組骨小梁區(qū)的空骨陷窩率進行分析比較。
　

6、　結果：誘導6周后，X線檢查可見模型組股骨頭外形完整，股骨頭和股骨近端皮質變薄、骨質密度欠均勻、可見點狀或線狀密度減低影。模型組MRI顯示T1WI表現(xiàn)為點狀、細線狀、片狀低信號，T2WI表現(xiàn)為點狀、細線狀、片狀高信號或低信號，F(xiàn)S T2WI中以股骨頭區(qū)域或股骨近端不均勻的點狀或片狀的低信號區(qū)為主，伴有少量積液。HE染色可見模型組骨小梁變細稀疏、排列紊亂、部分骨小梁斷裂，骨細胞形態(tài)變化明顯、多見核固縮，空骨陷窩廣泛存在;骨髓內(nèi)多見壞死液化

7、區(qū)，脂肪細胞增多、形態(tài)不規(guī)則、部分融合成大泡。空骨陷窩率計數(shù)結果顯示，經(jīng)LPS+MPS誘導后，股骨頭組織內(nèi)的空骨陷窩明顯增加（P＜0.05）。
　　結論：應用激素聯(lián)合內(nèi)毒素能誘導出典型的兔早期ONFH模型，成功率高，重復性好，為進一步研究氫氣干預激素性ONFH提供了動物模型基礎。
　　第二部分分子氫對體外培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞增殖和活性的影響
　　目的：初步觀察氫分子對體外培養(yǎng)成骨細胞、破骨前體細胞生長和活性的影響。<

8、br>　　方法：使用飽和氫培養(yǎng)基對K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨細胞和RAW264.7小鼠單核細胞進行培養(yǎng)，MTT法觀察飽和氫培養(yǎng)基對兩種細胞增殖的影響，并使用PNPP法檢測ALP活性。在應用RANKL誘導RAW264.7小鼠單核細胞向破骨細胞分化時，使用飽和氫培養(yǎng)基對破骨細胞進行培養(yǎng)，并用TRAP染色法觀察陽性多核破骨細胞形成情況并計數(shù)行統(tǒng)計分析。
　　結果：飽和氫培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)成骨細胞和破骨前體細胞增殖率，以及成骨細胞ALP活

9、性均無明顯作用(P＞0.05);使用飽和氫培養(yǎng)基對RANKL誘導破骨前體細胞RAW264.7分化形成的成熟多核破骨細胞有抑制作用，能明顯減少TRAP陽性破骨細胞的數(shù)量(P＜0.05)。
　　結論：分子氫在正常生理條件下對成骨細胞和破骨前體細胞的增殖和活性無明顯影響，但能明顯抑制RANKL誘導破骨前體細胞分化形成有功能活性的TRAP陽性多核破骨細胞。
　　第三部分氫氣吸入和髓芯減壓術治療兔早期激素性股骨頭壞死
　　目的：

10、通過氫氣吸入、髓芯減壓及兩者聯(lián)合對兔早期ONFH進行干預治療，運用影像學、組織學和分子生物學技術觀察評估治療效果，并對其可能的作用機制進行探討。
　　方法：應用激素聯(lián)合脂多糖誘導建立兔早期ONFH模型，誘導6周后行MRI檢查，取影像學表現(xiàn)較為明顯的動物隨機分組后進行后續(xù)實驗。共設6組:A.正常組(Norm組)，未行ONFH建模的正常動物;B.模型6周組（ONFH-6w組），經(jīng)LPS+MPS聯(lián)合誘導6周;C.模型14周組（ONFH-

11、14w組），建模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)8周，不予干預;D.氫氣吸入組（H2組），給予每日氫氣吸入40分鐘（濃度為4％）;E.髓芯減壓組(CD組)，給予鉆孔減壓手術處理;F.聯(lián)合處理組（H2+CD組），髓芯減壓術后給予氫氣吸入。建模8周后行髖關節(jié)X線檢查和MRI檢查，后對各組動物行股骨頭標本取材:脫鈣后行組織切片(n=6)，行HE染色、TUNEL法檢測、免疫組化染色(CD31、TM);骨組織勻漿(n=6)，行生化檢測MDA含量、Western-b

12、lot法檢測Caspase-3表達、ELISA法檢測8-OHdG含量，比較所得各數(shù)據(jù)并行統(tǒng)計學分析。
　　結果：干預治療8周后，X線檢查和MRI顯示H2組、CD組、H2+CD組股骨頭影像學表現(xiàn)較治療前無明顯變化，ONFH-14w組部分動物影像學表現(xiàn)較8周前明顯進展。HE染色顯示H2組、CD組、H2+CD組股骨頭空骨細胞陷窩率較治ONFH-14w組有明顯減少，且H2組、H2+CD組的空骨細胞陷窩率較ONFH-6w組減少，其差別有統(tǒng)計

13、學意義(P＜0.05);Western-blot法檢測Caspase-3相對含量和TUNEL法檢測凋亡陽性細胞數(shù)量結果顯示，H2組、CD組、H2+CD組股骨頭內(nèi)Caspase-3相對含量和凋亡陽性細胞數(shù)量均較ONFH-14w組減少，并且H2組、H2+CD組的Caspase-3相對含量和凋亡陽性細胞數(shù)量較CD組、ONFH-6w組均減少，其差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);MDA和8-OHdG的含量在H2組、H2+CD組中較CD組、ONFH

14、-6w組、ONFH-14w組明顯降低，其差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);免疫組化結果顯示CD31和TM染色陽性血管計數(shù)在H2組、CD組、H2+CD組中較ONFH-6w組、ONFH-14w組明顯增加，其差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而H2組、CD組、H2+CD組之間的血管計數(shù)并無明顯差別(P＞0.05)。
　　結論：氫氣吸入能明顯降低早期激素性ONFH后股骨頭內(nèi)氧化應激水平、減少細胞凋亡、改善血管內(nèi)皮細胞功能。氫氣治療結合髓芯