E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的作用與機制研究.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細胞（Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs）可以修復缺血損傷心肌的血管再生，改善損傷區(qū)域心肌的存活能力，可是BMSCs被移植到缺血損傷的心肌部位后存活率極低的現(xiàn)象卻嚴重妨礙了其血管再生和損傷修復功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)：缺血心肌區(qū)域炎癥反應所產(chǎn)生的炎性介質(zhì)是致使移植的BMSCs大面積凋亡的重要原因之一。本室前期研究證實，E1A激活基因阻遏子（Cellularrepress

2、orofE1A-stimulatedgenes，CREG）具有抑制多種細胞凋亡的生物學功能。因此，我們希望探討CREG修飾能否有效的抑制炎癥因子所誘導的BMSCs凋亡及其調(diào)控機制。
　　方法:1應用原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs為實驗細胞模型。2應用表達CREG的腺病毒載體感染BMSCs，以制備CREG基因修飾的BMSCs，應用Westernblot方法鑒定CREG基因在BMSCs中的表達效率。3用FITC-AnnexinV/PI雙染色

3、法和TUNEL法檢測添加20ng/mL腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激10h后controlBMSCs組、normBMSCs組、GFPBMSCs組、CREGBMSCs組的BMSCs凋亡率。4Westernblot方法檢測各相關蛋白的表達。
　　結(jié)果:通過FITC-AnnexinV/PI雙染色法和TUNEL法研究發(fā)現(xiàn)，Ad-CREG瞬時轉(zhuǎn)染的BMSCs可以有效抑制20ng/mLTNF-α刺激10h后誘導的凋亡，凋亡率明顯低于其他三

4、組并且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，正常的BMSCs在20ng/mLTNF-α刺激15min后細胞漿核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）表達量開始減少，而NF-κB結(jié)合抑制蛋白IκB的磷酸化活化現(xiàn)象增加。normBMSCs組和GFPBMSCs組細胞胞漿蛋白NF-κB和IκB的變化與controlBMSCs組相似。與之相反，TNF-α刺激15min后，檢測CREGBMSCs組的細胞胞漿蛋白發(fā)現(xiàn)，N

5、F-κB表達未見顯著減少，磷酸化的IκB表達也未見增加。進一步的核蛋白提取物檢測研究發(fā)現(xiàn)，normBMSCs組和GFPBMSCs組的NF-κB蛋白在TNF-α刺激15min后在核內(nèi)開始表達，而CREGBMSCs組則沒有NF-κB蛋白入核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象發(fā)生。
　　通過NF-κB的抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）200μM與細胞共培養(yǎng)預處理進一步證明，CREG表達抑制TNF-α誘導的BMSCs凋亡是通過抑制NF-κB活化和入核轉(zhuǎn)位完