基于光子晶體編碼液相芯片的腫瘤標志物分析.pdf

1、受到全球人口不斷增多，社會老齡化趨勢日益加重，環(huán)境不斷惡化，人們致癌行為逐漸增多等眾多因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前，惡性腫瘤已成為發(fā)展中國家的首要死因及發(fā)達國家的第二死因。如此驚人的高死亡率歸結于惡性腫瘤發(fā)病早期的隱蔽性和病程晚期缺乏有效的治愈手段。WHO推薦進行惡性腫瘤的二級預防工作，即惡性腫瘤的早期篩查、早期診斷和早期治療，并提示95％的惡性腫瘤可以通過早期發(fā)現(xiàn)與治療而治愈。影像學檢查和血清學檢查是兩

2、種有效的惡性腫瘤篩查手段，但是相比較而言，血清學檢查可以在更早期，即腫瘤細胞數(shù)目約108，瘤體直徑約0.5cm時，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的存在。腫瘤標志物是血清學檢查的目標物質，尤其是多個腫瘤標志物的聯(lián)合檢測可以極大地提高早期診斷率。同時，腫瘤標志物的檢測還能夠為腫瘤患者個體化治療方案的建立提供幫助。然而，目前臨床開展的此類實驗技術大都是單指標的分析方法，如果將其應用于人群惡性腫瘤的篩查，不僅成本高昂，而且費時費力，不易推廣。液相芯片技術是20世

3、紀末問世的一種多元分析技術，它由基因芯片技術演變而來，具備高通量的特性，并且方法靈敏度高，特異性好，是應用于腫瘤標志物檢測的理想分析技術。
　　液相芯片主要由編碼微球、探針分子、目標分子、報告分子四個部分組成，最初的編碼微球以熒光編碼為主，最具代表性的是Luminex公司商業(yè)化的xMAP技術。但是熒光編碼存在易于淬滅并導致編碼丟失或者誤編碼的問題。因此，多年來研究人員一直在尋找一種熒光編碼的替代方案。2002年，多孔硅光子晶體薄膜

4、首次被提出作為生物分子篩查的基底。2006年，具有三維結構的自組裝光子晶體微球首次被制作出并應用于液相芯片的載體進行多元生物分子檢測。
　　本論文探討了以光子晶體編碼微球作為載體的液相芯片技術在腫瘤標志物多元分析中的應用，工作主要分為三個部分，其內容與創(chuàng)新點如下:
　　一、基于二氧化硅光子晶體微球陣列的腫瘤多藥耐藥基因表達情況的多元分析。應用可控的多元PCR技術對篩選出的多藥耐藥基因1(multidrug resistanc

5、e1gene，MDR1)和多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein1，MRP1)兩段目標基因的特征性片段進行擴增，以反應條件優(yōu)化后的基于雙探針雜交反應的二氧化硅光子晶體微球陣列對擴增后的特征性片段進行定量分析，通過分析結果與標準熒光濃度曲線的比對獲得目標基因的起始濃度，從而建立了一種可用于基因表達情況分析的多元分析技術。這種多元分析技術操作簡便，成本低廉。實驗中應用的信號放大技術

6、是常用的PCR擴增技術，但是為了保證擴增后的終產(chǎn)物與起始濃度的相關性，擴增循環(huán)數(shù)目受到嚴格的控制，成為可控PCR擴增。這樣的信號放大策略是在以前的文獻報道中從未出現(xiàn)過的。
　　二、基于復合材料光子晶體微球陣列芯片的快速、多元腫瘤蛋白標志物分析。通過第一部分實驗發(fā)現(xiàn)單純的二氧化硅光子晶體微球在檢測中存在諸多問題，想要建立重復性更好的檢測方法首先必須對微球載體進行針對性的創(chuàng)新優(yōu)化、改造升級。因此，二氧化硅和水凝膠復合材料光子晶體微球被

7、開發(fā)出來。這兩種材料互相彌補了對方的不足之處，同時使得微球保有二氧化硅微球和水凝膠微球各自的優(yōu)點。之后，基于此種復合材料微球的多元檢測實驗方案也得到了確立，使得光子晶體微球陣列的檢測靈敏度得到極大的增強。同時，為了方法最終能夠標準化，配套的盒式芯片裝置也被開發(fā)出來應用于增強方法的可操作性和重復性。
　　三、基于反蛋白石結構水凝膠光子晶體微球陣列的超敏蛋白檢測。隨著蛋白組學研究的推進，更多、更靈敏且特異性更好的腫瘤標志物被發(fā)現(xiàn)，例如

8、胃泌素釋放肽前體(Pro-Gastrin-Releasing Peptide，ProGRP)對于小細胞肺癌的診斷具有很高的靈敏度和器官特異性。ProGRP在血清中的含量極低，達到pg/ml的數(shù)量級。因此，未來惡性腫瘤篩查工作所應用的檢測技術必須同時滿足高靈敏度檢測和多元檢測的條件?？墒牵壳伴_展的實驗室分析技術多為單指標分析技術，應用于惡性腫瘤篩查費時費力?；诜吹鞍资Y構水凝膠光子晶體微球陣列的液相芯片技術可以達到新一代標志物的檢測靈

9、敏度，同時也能進行多元分析，是一種理想的可用于人群篩查的檢測方法。該方法以反蛋白石結構的水凝膠光子晶體微球作為載體，充分利用了微球在反應過程中發(fā)生溶脹，反應結束后在高濃度乙醇的作用下發(fā)生脫水而回縮的特性，不僅完成了檢測信號的放大，提高了檢測靈敏度，同時解決了水凝膠微球在反應液中發(fā)生溶脹而丟失編碼的問題。基于毛細管微流控實驗裝置的搭建進一步提高了實驗的重復性和操作簡便性。
　　隨著對光子晶體編碼微球芯片的研究不斷深入，它的潛在應用價