溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)“針狀樣”毒力裝置相關基因功能的研究.pdf

1、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）Ⅲ型分泌系統(tǒng)的“針狀樣”毒力裝置(Needle-likeinjectisome)又稱為注射小體，是Ⅲ型分泌系統(tǒng)中一個復雜的微型裝置，負責將效應蛋白傳輸?shù)秸婧思毎?。注射裝置從細菌細胞質(zhì)基質(zhì)向外伸出內(nèi)中空的針到達宿主細胞表面，該注射過程一共橫跨三層膜。本研究成功克隆并分析了注射裝置上兩個重要因子:vscP基因和vscX基因。vscP基因ORF為1206 bp，共編碼401個氨基酸殘基，分子

2、質(zhì)量約為44.4 kD，等電點為5.72。構建VscP亞基三維結構模型發(fā)現(xiàn)，其與鞭毛FilK蛋白有相似構型。vscX基因ORF為378bp，共編碼125個氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為14.2 kD，等電點為5.75。網(wǎng)絡互作分析結果顯示vscX與vscY、 vopB、sycN等有相鄰的關系。VscP和VscX各自具有一個重要結構域，分別是T3S4(369-389aa)結構域和Pfam(1-125aa)結構域。
　　運用實時熒光定量PC

3、R技術，結合2-△△Ct法分析VscP和VscX在分別在溶藻弧菌野生株HY9901、Ⅲ型分泌系統(tǒng)護航蛋白缺失株△vscO和互補株C-vscO菌株中不同生長時期的mRNA表達差異。結果顯示，VscP和VscX的mRNA表達量均隨溶藻弧菌HY9901生長而增長，在生長平緩期顯著上調(diào)(p＜0.01)。在vscO基因缺失后，VscP和VscX的mRNA表達量均在生長晚期顯著上調(diào)(p＜0.01)，說明vscO的缺失破壞了VscO與VscP、Vsc

4、X之間的協(xié)同關系，使得VscP和VscX在生長晚期表達過剩。
　　選取VscP抗原制備亞單位疫苗，首先構建重組質(zhì)粒pGEX-vscP，并轉化到大腸桿菌中表達;然后以28℃，0.4 mM IPTG，5h的最優(yōu)條件培養(yǎng)獲得重組蛋白，并用GST標簽的純化柱純化;最后，VscP抗原免疫多鱗鱚(Sillago sihama Forskál)，溶藻弧菌、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）攻毒兩周后，VscP抗原對多鱗鱚的相對免疫保護率

5、分別為67.7％、86.6％，說明VscP抗原有望成為制備具有交叉保護作用的亞單位疫苗的良好材料。
　　首次應用蛋白質(zhì)組學方法研究VscP蛋白免疫多鱗鱚后其脾臟蛋白的表達差異，應用雙向凝膠電泳技術和質(zhì)譜分析技術對蛋白進行分離鑒定，結果表明，VscP蛋白免疫組所得蛋白點為1316個，免疫前對照組所得蛋白點為1149個， PBS對照組所得蛋白點為1291個，PBS+佐劑對照組所得蛋白點為1316個。與對照組相比，在免疫組發(fā)現(xiàn)9個差異蛋