多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株與RND型和MATE型外排泵的研究.pdf

1、目的：鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性近年呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。主動(dòng)外排泵與細(xì)菌耐藥密切相關(guān)。本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法研究鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株的多重耐藥表型、泵抑制劑的干預(yù)作用及主動(dòng)外排系統(tǒng)：RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因攜帶、表達(dá)及外排泵AdeABC的調(diào)控系統(tǒng)AdeRS的基因序列變化情況，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物、減少細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)或傳播、新型抗菌藥物的研制提供依據(jù)。 方

2、法： 1、菌株收集、藥敏試驗(yàn)與泵抑制劑干預(yù)試驗(yàn)：收集自2006年1月至2008年6月期間天津市3家三級(jí)甲等醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共35株，其中多重耐藥株30株，敏感株5株。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂紙片擴(kuò)散法測(cè)定臨床菌株對(duì)13種常用抗菌藥物（哌拉西林、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星）的MIC值，分析耐藥率。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定

3、未加用和加用泵抑制劑CCCP時(shí)菌株對(duì)8種抗菌藥物（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦）的MIC值，分析泵抑制劑對(duì)菌株耐藥表型的影響。 2、RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因檢測(cè)及mRNA的表達(dá)：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增全部實(shí)驗(yàn)菌株的adeB、adeJ和abeM基因，選擇10株多重耐藥株和5株敏感株進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以內(nèi)參基因r

4、ecA為對(duì)照，進(jìn)行凝膠掃描半定量分析。 3、RND型外排泵AdeABC的調(diào)控系統(tǒng)AdeRS的編碼基因檢測(cè)及序列分析：應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增adeR和adeS基因，選擇2株多重耐藥株和2株敏感株的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，并與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)分析。 結(jié)果： 1、藥敏試驗(yàn)結(jié)果和泵抑制劑對(duì)耐藥表型的影響：30株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)抗菌藥物的耐藥率為：環(huán)丙沙星（100％），氧氟沙星（100％），哌拉西林（100

5、％），頭孢噻肟（100％），頭孢他定（100％），頭孢哌酮（100％），頭孢曲松（100％），頭孢吡肟（100％），慶大霉素（100％），阿米卡星（100％），左氧氟沙星（50％），頭孢哌酮/舒巴坦（26．67％），亞胺培南（10％）。30株多重耐藥株在使用CCCP后均出現(xiàn)了對(duì)一種或一種以上抗菌藥物的MIC值較前下降4倍或4倍以上。5株敏感株在應(yīng)用CCCP后，其中2株對(duì)氧氟沙星的MIC值較前下降2倍，1株對(duì)頭孢他定的MIC值較前下降2倍

6、，2株對(duì)慶大霉素的MIC值較前下降2-4倍。 2、外排泵基因檢測(cè)及mRNA的表達(dá)情況：30株多重耐藥株和5株敏感株均攜帶泵基因adeB、adeJ和abeM，10株多重耐藥株的adeB相對(duì)表達(dá)水平（灰度）為（1．211-9．169），而adeB基因在5株敏感株中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá)；10株多重耐藥臨床株的adeJ相對(duì)表達(dá)水平（灰度）為（0．956-4．519），平均1．75；5株敏感株為（0．356-0．576），平均0．426

7、；abeM基因在10株多重耐藥株和5株敏感株中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá)。 3、調(diào)控基因adeRS的檢測(cè)及序列比對(duì)：檢測(cè)2株敏感株AbS2與AbS5的adeR序列相同，與GenBank中公布的AY426969比對(duì)，同源性為97％。耐藥株AbM1與AbM4的adeR基因序列相同，與AY426969比對(duì)同源性為97％。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeR基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)出現(xiàn)：Ile14→Val、Val120→Ile、

8、Ala136→Val。AbS2與AbS5的axles序列相同，與AY426969比對(duì)同源性為97％。AbM1與AbM4的adeS基因序列相同，與AY426969比對(duì)同源性為96％。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeS基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)出現(xiàn)：Gly186→Val、Asn213→Asp，Ile285→Leu，Asn268→His，Val331→Ile，Val348→Ile、Gly356→Asn、His357→Asn，357

9、位后氨基酸缺失。 結(jié)論： 1、泵抑制劑CCCP的應(yīng)用，可使鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥株對(duì)一種或多種抗菌藥物MIC值較前降低，這表明外排泵功能對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥有一定貢獻(xiàn)。 2、RND型外排泵基因adeB和adeJ在10株多重耐藥株和5株敏感株中的表達(dá)差異，可能與鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥有關(guān)。MATE型外排泵基因abeM在多重耐藥株和敏感株中均未檢測(cè)到mRNA的表達(dá)，有待擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)例數(shù)進(jìn)一步研究。 3、2株多重耐