埃茲蛋白在TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷中表達(dá)變化及Rac1的影響.pdf

1、背景與目的：
　　埃茲蛋白（Ezrin）是細(xì)胞骨架橋接蛋白ERM(Ezrin-Radixin-Moesin)家族成員之一,主要分布于細(xì)胞皮層。Ezrin作為膜蛋白和肌動(dòng)蛋白連接蛋白，通過(guò)ERM家族特征性FERM(four-point-one protein，ezrin,redixin,moesin)功能域?qū)さ鞍着c肌動(dòng)蛋白連接，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)，在調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、生存、黏附、增殖和遷徙等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，

2、用特異性 Ezrin小干擾RNA作用于腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）刺激的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMVEC），磷酸化的Ezrin減少，可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加。但在肺炎癥損傷過(guò)程中，Ezrin具體通過(guò)哪些信號(hào)傳導(dǎo)通路參與其中，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)TNF-α建立大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat pul

3、monary microvascular endothelial cell，RPMVEC）損傷模型，探討RPMVEC炎性損傷與Ezrin表達(dá)量及磷酸化之間的關(guān)系，以及Ezrin在急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS)發(fā)病機(jī)制中的作用和小G蛋白家族成員Rac1對(duì)Ezrin在TNF-α致RPMVEC炎性損傷中的影響。
　　方法：
　　1）體外肺組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原

4、代RPMVECs；
　　2）蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western-blotting technique）檢測(cè)TNF-α刺激RPMVECs后各時(shí)間點(diǎn)Ezrin及其磷酸化的表達(dá)水平。
　　3）蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)測(cè)定NSC23766刺激RPMVECs后不同時(shí)間點(diǎn)Ezrin及p-Ezrin的表達(dá)；
　　結(jié)果
　　1）體外成功分離培養(yǎng)出原代RPMVECs，經(jīng)光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定。
　　2）RPMV

5、ECs中僅低量表達(dá)Ezrin，且TNF-α刺激對(duì)Ezrin無(wú)明顯影響。10μg/L TNF-α刺激RPMVECs不同時(shí)間（0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h）后發(fā)現(xiàn)：Ezrin表達(dá)無(wú)變化。而TNF-α可呈時(shí)間依賴(lài)性增加Ezrin磷酸化，相對(duì)表達(dá)量分別為（0.21±0.33）、（0.53±0.19）、（0.95±0.24）、（1.07±0.30）、（1.68±0.30）、（1.32±0.37）、（0.93±0.2

6、0）、（0.87±0.18），0.25 h（0.53±0.19）時(shí)開(kāi)始高于0 h（0.21±0.33），3h（1.68±0.30）達(dá)峰值且顯著高于0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、6 h、12 h、24 h（均P＜0.001），24 h（0.87±0.18）仍高于0 h。各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.2，P<0.001)。
　　3）與空白對(duì)照組（0.68±0.16）比較，單獨(dú)使用10μg/L TNF-α（0.92±

7、0.12）或200μmol/L NSC23766（1.33±0.24）刺激均能誘導(dǎo)p-Ezrin表達(dá)量增加（t＝-2.864、P＝0.020，t＝-5.429、P＝0.000）；將NSC23766與TNF-α共同刺激（2.14±0.18）能明顯提高p-Ezrin表達(dá)量，與TNF-α（0.92±0.12）單獨(dú)刺激組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t＝-14.670，P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　1）RPMVECs僅低量表達(dá)Ezrin，