炎癥因子上調SREBP-1致小鼠原代肝細胞脂質異常聚集及損傷.pdf

1、本文從以下幾方面進行了詳細闡述。
　　第一部分小鼠原代肝細胞的分離與培養(yǎng)。
　　目的:肝臟是脂質代謝的重要器官，建立小鼠原代肝細胞的體外培養(yǎng)技術，用于后續(xù)脂代謝研究。
　　方法:采用Ⅳ型膠原酶原位二步灌流法分離小鼠原代肝細胞。用臺盼藍試劑對新鮮分離的細胞進行染色以檢測細胞活率，并在不同時間點觀察細胞貼壁情況和培養(yǎng)基中白蛋白的分泌情況。通過對肝細胞白蛋白進行免疫細胞化學染色和糖原染色，完成對肝細胞的鑒定。
　　結果

2、:臺盼藍結果顯示:本法所制得的小鼠原代肝細胞活率最高可達90％。剛分離的肝細胞大多數(shù)呈單個球形，具有一定立體感。4小時后肝細胞已基本貼壁，可見肝細胞的典型的雙核結構，胞質呈扁平狀。1天后雙核更加明顯，核仁清晰可見，胞質貼壁更加扁平，2天后細胞成多邊形，并維持此形態(tài)數(shù)天。免疫細胞化學染色和糖原染色顯示，所培養(yǎng)細胞基本均可合成白蛋白和糖原，并且一周以內都可以在培養(yǎng)基中檢測到細胞分泌的白蛋白。
　　結論:小鼠原代肝細胞的分離與培養(yǎng)技術建

3、立成功，在一周內具有較好的形態(tài)和功能，可進行后續(xù)實驗。
　　第二部分炎癥因子對小鼠原代肝細胞脂質積聚及損傷的影響。
　　目的:近年來的研究發(fā)現(xiàn)，慢性系統(tǒng)性炎癥在代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展中有十分重要的作用。我們通過建立原代肝細胞分離與培養(yǎng)技術，在體外模擬肝細胞正常生理狀態(tài)，探討炎癥因子是否能造成小鼠原代肝細胞脂質的聚集及損害。
　　方法:將培養(yǎng)的小鼠原代肝細胞分為以下6個組:Control組、軟脂酸組(PA)組、炎癥因子T

4、NF-α組和IL-6組、PA+TNF-α組和PA+IL-6組。定量檢測細胞內甘油三酯和游離脂肪酸水平及油紅O染色法來觀察各組細胞的脂質沉積情況。熒光定量PCR法檢測內質網應激指標IRE1，ATF6，GRP78水平。通過測定過氧化氫以及活性氧水平來檢測細胞的氧化應激狀態(tài)。
　　結果:給予炎癥因子TNF-α或IL-6炎癥刺激后，小鼠原代肝細胞的甘油三酯的含量出現(xiàn)了明顯升高;即使在高脂肪酸背景下，炎癥因子同樣也能刺激脂肪酸和甘油三酯的含

5、量。這與肝細胞的油紅O染色結果一致。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，內質網應激指標IRE1，ATF6，GRP78的基因表達水平以及氧化應激指標ROS和H2O2水平與脂肪酸和甘油三酯含量變化趨勢基本一致。
　　結論:炎癥因子可使脂質在小鼠原代肝細胞內異常積聚，進而還可引起氧化應激和內質網應激而使肝細胞受損。
　　第三部分炎癥因子對SREBP-1及其下游靶基因表達的影響。
　　目的:SREBP-1是一種在肝臟中含量豐富的核轉錄因子，主要通

6、過調控下游靶基因ACCα和FAS的表達，進而調節(jié)脂肪酸的合成，影響肝臟內甘油三酯的含量。本研究旨在探討炎癥因子對SREBP-1、ACCα和FAS表達的影響。
　　方法:按第二部分的方法對原代肝細胞進行分組。采用熒光定量PCR法檢測炎癥因子對小鼠原代肝細胞中SREBP-1、ACCα和FAS基因水平變化，同時采用蛋白免疫印跡（Western Blotting）的方法觀察炎癥因子對小鼠原代細胞中SREBP-1、ACCα和FAS蛋白表達情