外周Th17-Treg失衡在動脈粥樣硬化中的作用及全反式維甲酸對其的影響和機制.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心腦血管病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病，目前機理尚未完全闡明。越來越多的證據(jù)表明AS是一種慢性炎性病變，炎癥反應(yīng)是AS的主要發(fā)病機制，固有的和獲得性的免疫炎癥機制參與了此疾病的發(fā)展過程。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)主要包括急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）和不穩(wěn)定性心絞痛（

2、unstable angina，UA），其病理生理基礎(chǔ)是冠狀動脈粥樣硬化斑塊在多種因素作用下穩(wěn)定性被破壞，導(dǎo)致斑塊破裂，并繼發(fā)血栓形成。冠狀動脈粥樣斑塊免疫炎性反應(yīng)是導(dǎo)致斑塊破裂形成ACS的重要機制之一。因此，深入研究AS和ACS發(fā)生的免疫機制，尋找新的拮抗AS和ACS的藥物具有重要醫(yī)學(xué)意義。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+regulatory T cells，Treg）和輔助性T細(xì)胞17（T help

3、 cell 17，Th17）是兩類不同于Th1和Th2的CD4+T淋巴細(xì)胞。Treg細(xì)胞可有效控制自身免疫性疾病和維持自身免疫耐受，其數(shù)量和功能的改變與腫瘤、感染、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)，Thl7細(xì)胞是近來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T細(xì)胞的新亞型，具有很強的促炎癥作用，與多種自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Treg細(xì)胞和Thl7細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，二者在功能上互相拮抗，兩者的平衡在組織炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

4、然而，在AS，尤其是ACS形成中的作用，尚未進行深入探討。
　　 氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）與動脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān)，ox-LDL可通過多種途徑損傷血管內(nèi)皮，促進平滑肌細(xì)胞的增殖和泡沫細(xì)胞的形成，從而導(dǎo)致脂質(zhì)條紋和粥樣斑塊的形成，并可影響斑塊的穩(wěn)定性和導(dǎo)致ACS的發(fā)生。然而，ox-LDL是否也通過破壞Th17/Treg平衡而促進AS和ACS形成，目前尚不

5、清楚。
　　 全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的主要衍生物。ATRA作為重要的生物活性物質(zhì)，具有激素樣作用，在體內(nèi)產(chǎn)生廣泛的生物效應(yīng)。已有文獻報道ATRA在Treg和Th17細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究首先檢測ACS患者外周血Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量、功能和相關(guān)細(xì)胞因子表達，探討ACS患者外周Th17/Treg平衡的變化，然后通過細(xì)胞實驗分析ATRA和ox-L

6、DL對Th17/Treg平衡的影響，并從其對Treg和Th17細(xì)胞分化的影響來探討其機理；同時從細(xì)胞凋亡的角度探討ACS患者Th17/Treg失衡的機制；最后復(fù)制早期大鼠AS模型，通過體內(nèi)實驗驗證ATRA對Th17/Treg平衡的影響以及在AS發(fā)生中的作用，從而為今后預(yù)防和控制AS提供新的方法和依據(jù)，同時也為今后進一步開發(fā)治療AS的藥物提供新的思路。
　　 目的：明確Th17/Treg平衡在AS中的作用和意義，并分析ATRA和o

7、x-LDL對Th17/Treg平衡的影響和對在AS形成中的作用，探討Th17/Treg失衡的機制和ATRA影響平衡的機理。
　　 方法：（1）本實驗首先以冠脈造影正常的對照組和AMI、UA、穩(wěn)定性心絞痛（stable angina，SA）患者為研究對象，采用多色免疫熒光素法標(biāo)記細(xì)胞抗原，包括細(xì)胞膜表面和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD127、FoxP3、IL-17等，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組患者外周血Treg和Th17細(xì)胞表

8、達水平；并應(yīng)用FACS分選CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25-T細(xì)胞，進行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，比色法測定CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞的抑制功能；RT-PCR檢測Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Treg細(xì)胞Foxp3表達水平；ELISA法檢測人血清細(xì)胞因子水平IL-10、IL-17和ox-LDL表達情況；分析血清ox-LDL與Treg和Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性，并通過細(xì)胞實驗檢測ox-LDL對Treg和

9、Th17細(xì)胞數(shù)量和功能的影響。（2）通過細(xì)胞實驗和凋亡檢測進行機制探討；ATRA和ox-LDL體外干預(yù)檢測其對各組患者Th17/Treg失衡的作用，并通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)實驗從Treg和Th17細(xì)胞分化的角度分析ATRA影響Th17/Treg平衡的機制；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞凋亡和Fas/FasL表達，從細(xì)胞凋亡的角度分析ACS患者Treg減少和Th17/Treg失衡的可能機理。（3）采用高脂飲食和免疫損傷相結(jié)合，復(fù)制大鼠早期AS模

10、型，檢測各組Treg和Th17細(xì)胞表達情況，通過體內(nèi)實驗進一步驗證ATRA對Th17/Treg平衡和AS發(fā)生的影響。
　　 結(jié)果：（1）ACS患者外周Treg細(xì)胞表達率、相關(guān)細(xì)胞因子IL-10水平和Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FoxP3表達顯著降低，Treg細(xì)胞抑制功能明顯減弱；而外周Th17細(xì)胞表達率、相關(guān)細(xì)胞因子IL-17水平和Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達顯著增強。AMI和UA患者Treg/Th17比值顯著低于SA患者和對照組

11、(均P<0.01)。絕大部分對照組正常人CD4+CD25+CD127low/Th17比例大于5，SA組患者為2-4，UA患者1-1.5，AMI患者<0.7。AMI和UA患者血清ox-LDL濃度顯著高于SA患者和NCA正常人（P<0.01）；此外，血清ox-LDL濃度與Treg細(xì)胞表達率呈顯著負(fù)相關(guān)，而與Th17細(xì)胞表達率呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，隨著ox-LDL濃度的增加和作用時間的延長，Treg細(xì)胞表達率降低，而Th

12、17細(xì)胞表達率升高；ACS患者對ox-LDL誘導(dǎo)的Treg和Th17細(xì)胞變化更為敏感，變化程度顯著高于SA患者和對照組。（2）ATRA共同處理組Treg細(xì)胞表達水平明顯高于ox-LDL處理組（均P<0.01），Treg細(xì)胞抑制功能也明顯增強；而Th17細(xì)胞表達率顯著低于ox-LDL處理組（均P<0.01）；正常人和SA患者PBMCs與ATRA作用48h后，其Treg和Th17細(xì)胞表達水平、Treg細(xì)胞抑制功能已與細(xì)胞對照接近，而UA和A

13、MI患者也有顯著恢復(fù)。正常人PBMC經(jīng)TGF-β1和IL-2誘導(dǎo)72h后，Treg細(xì)胞表達顯著增強；經(jīng)IL1-β、IL-6和IL-23誘導(dǎo)72h后，Th17細(xì)胞表達也明顯增強；與細(xì)胞因子誘導(dǎo)組比較，ATRA處理組Treg細(xì)胞表達水平顯著增高，而Th17細(xì)胞表達水平明顯下降（均P<0.01）；而ox-LDL處理組Treg和Th17細(xì)胞表達無明顯變化（均P＞0.05）。因此，ATRA可通過作用于Treg和Th17細(xì)胞分化，影響Th17/Tr

14、eg平衡。ACS患者Treg細(xì)胞凋亡較NCA對照和SA患者明顯增加（P<0.01），進一步檢測發(fā)現(xiàn)ACS患者Fas和FasL表達水平均顯著增強（均P<0.05）。（3）動物實驗HE染色顯示免疫高脂組動脈內(nèi)膜增生明顯，內(nèi)皮下有大量泡沫細(xì)胞沉積，免疫組及ATRA組動脈病變程度比免疫高脂組減輕，正常組及高脂組動脈內(nèi)膜連續(xù)完整。高脂組及免疫高脂組大鼠血清總膽固醇值較正常組、免疫組增加有顯著性差異(P<0.05)，而ATRA處理組與各組間差異無統(tǒng)

15、計學(xué)意義。免疫組和免疫高脂組Treg細(xì)胞表達水平較正常組和高脂組顯著降低(P<0.05，P<0.01)，而Th17細(xì)胞表達水平較正常組和高脂組顯著升高(P<0.05)；ATRA處理組較免疫高脂組Treg細(xì)胞表達明顯升高(P<0.05)，而Th17細(xì)胞表達明顯降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：（1）采用免疫損傷結(jié)合高脂飲食誘導(dǎo)成功建立早期AS大鼠模型。（2）ACS患者和早期AS大鼠模型均存在Treg和Th17細(xì)胞平衡失調(diào)，Th1

16、7/Treg失衡與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，從而為AS和ACS的預(yù)防和治療提供新的靶點；此外，Th17/Treg平衡還可作為ACS早期診斷和動態(tài)監(jiān)測的敏感指標(biāo)。（3）ox-LDL可直接影響Th17/Treg平衡，使平衡向Th17偏移，進而引起斑塊不穩(wěn)定和ACS的發(fā)生，其機制可能并不通過影響Treg和Th17細(xì)胞分化完成。（4）細(xì)胞實驗和動物實驗均表明，ATRA可上調(diào)Treg表達，同時降低Th17水平，有效改變Th17/Treg失衡狀態(tài)，從而