表達HPV16E7可移植小鼠腫瘤細胞系的初步建立.pdf

1、浙江大學碩士學位論文表達HPV16E7可移植小鼠腫瘤細胞系的初步建立姓名：謝樹奪申請學位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學指導教師：王林波2002.5.1塹姿盔堂匿堂墮——————————絲生蘭墮絲羔——一提供一些實驗基礎和經驗。／方法：＼1重組真核表達載體的構建沒計分別含EcoRI和＆D廳V限制性酶切位點的一對引物，通過PCR反應產生HPVl6E7基因。然后回收純化PCR產物，亞克隆到pGEM—T克隆載體。提取亞克隆質粒酶切鑒定后，雙酶切并回收純

2、化切下的HPVl6E7基因。最后，回收產物連接真核表達載體pcDNA31()，酶切并測序鑒定重組表達載體。真核表達載體命名為pcDNA31／HPVl6E7。2轉染和抗性細胞克隆篩選用脂質體法轉染重組表達載體于B16細胞，孵育3小時后換液。轉染后24小時，l：5傳代G418800ug／ml篩選，之后每2—3天換液一次。14天后可見抗性細胞克隆生成，用毛細管法挑取克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)。3陽性細胞克隆鑒定當克隆長滿6孔板時，用Trizol法提取每

3、個克隆的總RNA。然后以GAPDH為內對照用HPVl6E7引物進行RT—PCR檢測HPVl6E7表達的陽性克隆細胞株。結果：我們成功構建含HPVl6E7基因的重組表達載體，并通過酶切及測序鑒定。經該載體轉染的B16細胞，用G418篩選lO—14天后出現抗性克隆。我們用毛細管法成功挑取克隆，并擴大培養(yǎng)。RT—PCR檢測抗性克隆細胞，發(fā)l貼，32個抗性克隆中有24個克隆HPVl6E7mRNA表達陽性，其中8個表達較強。V結論：1成功構建真核