牛傳染性鼻氣管炎抗體膠體金免疫層析方法的建立.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒也稱牛皰疹病毒Ⅰ型引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床癥狀有上呼吸道及氣管粘膜發(fā)炎，并伴有結(jié)膜炎、流產(chǎn)、乳腺炎等。更嚴(yán)重的危害是持續(xù)性感染，使得該病的診斷、預(yù)防及治療極為困難。該病的現(xiàn)場診斷中，現(xiàn)有的抗體檢測方法存在許多弊端，因此建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的抗體檢測方法非常必要。
　　本研究根據(jù)GenBank中已公布的牛傳染性鼻氣管炎病毒的全基因序列，利用DNAstar對牛傳染性鼻氣管炎

2、病毒的主要抗原糖蛋白gB進(jìn)行預(yù)測分析，選出3段抗原指數(shù)高的氨基酸序列對應(yīng)的基因片段gBa、 gBb和gBc，將3段基因序列融合后合成得到重組克隆載體PUCK-gBabc。將融合基因gBabc定向插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET28a-gBabc，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。通過SDS-PAGE電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，重組陽性菌誘導(dǎo)2h后融合蛋白表達(dá)量最

3、大，其分子大小約為44.3kDa(含3.5kDa的pET-28a(+)肽段）。經(jīng)Weatern blot鑒定證實(shí)融合蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。
　　純化后的融合蛋白gBF經(jīng)透析復(fù)性作為檢測線上的包被抗原，劃線濃度為0.6mg/mL。質(zhì)控線上用提純的兔IgG作為捕獲蛋白，劃線濃度最終確定為1.5mg/mL。SPA用15NM的膠體金溶液標(biāo)記，標(biāo)記PH設(shè)為6.0，SPA標(biāo)記濃度控制在0.1mg/mL，最后得到金標(biāo)-SPA濃縮液，使用前用

4、復(fù)溶緩沖液5倍稀釋后涂覆在金標(biāo)墊上。劃線好的NC膜及處理好金標(biāo)墊和樣品墊放于37℃培養(yǎng)箱中烘干30min，切條后裝卡槽，制成用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試紙條。用牛傳染性鼻氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清對本試驗(yàn)制備的檢測試紙條進(jìn)行有效性驗(yàn)證，結(jié)果在檢測牛傳染性鼻氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清時(shí)，出現(xiàn)兩條紅色反應(yīng)帶，呈陽性反應(yīng)，檢測陰性血清時(shí)只在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶，呈陰性反應(yīng)，表明驗(yàn)證結(jié)果正確;交叉試驗(yàn)結(jié)果證明制備的試紙條與牛副結(jié)