APE1 siRNA與p53聯(lián)合基因治療肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，由于難于早期發(fā)現(xiàn)，發(fā)病后患者的生存期很短、病死率高，目前臨床采用的多種傳統(tǒng)治療手段都不能收到滿意的效果?；蛑委熓钱?dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)新的的研究領(lǐng)域，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，基因治療研究的重點(diǎn)逐漸由單基因缺陷所致的遺傳病轉(zhuǎn)向腫瘤這種多基因參與、多步驟形成的疾病。腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程復(fù)雜，涉及多種基因異常，聯(lián)合基因治療成為當(dāng)前腫瘤基因

2、治療研究的發(fā)展方向。 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease1，APE1)具有DNA損傷修復(fù)及氧化還原雙重功能，是一種多功能蛋白，對(duì)維持DNA的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)具有重要作用。APE1蛋白的不正常表達(dá)、分布及功能改變與抗細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。野生型p53基因是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，p53基因突變與HCC發(fā)生密切相關(guān)。HCC細(xì)胞凋亡能力下降推測(cè)與APE1過表達(dá)及p53

3、突變有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肝癌組織中APE1和突變型p53的表達(dá)，分析其與肝癌演進(jìn)及p53基因突變的關(guān)系，并在體內(nèi)外應(yīng)用重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合Ad-p53感染肝癌細(xì)胞，通過觀察體內(nèi)外肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果，探討二者聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為聯(lián)合基因治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的: 1.探討DNA損傷修復(fù)基因APE1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與腫瘤演進(jìn)及p53基因突變的關(guān)系；

4、 2.體外聯(lián)合感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制協(xié)同效應(yīng)； 3.體內(nèi)聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)研究對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制協(xié)同作用。 研究?jī)?nèi)容和方法: 1.肝癌組織APE1和p53蛋白表達(dá)及其臨床意義： 采用免疫組化方法檢測(cè)肝癌組織APE1和p53蛋白表達(dá)，分析APE1表達(dá)與肝癌臨床病理因素及p53突變之間的關(guān)系，為進(jìn)一步以APE1和p53為靶點(diǎn)的基因治療提供臨床病理基礎(chǔ)。 2.重組腺病毒Ad5/F35-AP

5、E1siRNA聯(lián)合Ad-p53體外抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究： 采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光檢測(cè)Ad5/F35-APE1siRNA和Ad-p53對(duì)肝癌細(xì)胞感染效率；Westernblot檢測(cè)Ad5/F35-APE1siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞APE1基因的沉默作用，及Ad-p53對(duì)肝癌細(xì)胞p53基因的增強(qiáng)作用；免疫組化檢測(cè)Ad5/F35-APE1siRNA和Ad-p53在肝癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染目的基因與相應(yīng)蛋白表達(dá)的時(shí)效關(guān)系；MTT法檢測(cè)腺病毒感染

6、滴度與細(xì)胞存活的關(guān)系；臺(tái)盼藍(lán)染色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)腺病毒聯(lián)合抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；TUNEL法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。 3.重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合Ad-p53體內(nèi)抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究： 建立肝癌裸鼠動(dòng)物模型，觀察Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合Ad-p53對(duì)肝癌生長(zhǎng)抑制的協(xié)同作用，測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，HE染色，光鏡觀察腫瘤的組織學(xué)變化，免疫組化和TUNEL

7、法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞APE1和p53表達(dá)、細(xì)胞凋亡。 研究結(jié)果: 1.肝癌組織APE1和p53蛋白表達(dá)及其臨床意義： 正常肝臟組織APE1呈胞核陽性，肝硬化和HCC組織APE1表達(dá)特征發(fā)生改變，呈胞核表達(dá)、單純胞漿表達(dá)或核漿共同表達(dá)。APE1胞核表達(dá)在HCC、肝硬化及正常肝相互間比較均無顯著差異；APE1核漿共表達(dá)在三組間比較均具有顯著差異(p＜0.01)；APE1胞漿表達(dá)僅在4例HCC發(fā)現(xiàn)。APE1胞核陽性分度和胞漿

8、陽性分度在正常肝、肝硬化、HCC中比較有顯著差異(p＜0.01)，且與HCC組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。HCC組織中p53陽性率60.2％，與APE1表達(dá)方式無相關(guān)性；APE1/p53不同表達(dá)狀態(tài)的HCC組織學(xué)分級(jí)有明顯差異(p＜0.01)，APE1異位表達(dá)/p53+的HCC惡性程度高。 2.重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合Ad-p53體外抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究： 重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA和A

9、d-p53的最佳感染效率分別為20MOI、50MOI。Ad5/F35-APE1siRNA能有效抑制肝癌細(xì)胞APE1的表達(dá)，48～72h達(dá)到最大抑制；Ad-p53能有效增強(qiáng)肝癌細(xì)胞p53的表達(dá)，48～72h達(dá)到最高。重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA和Ad-p53均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，聯(lián)合感染時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及抑制作用均明顯增強(qiáng)(p＜0.01)。 3.重組腺病毒Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)

10、合Ad-p53體內(nèi)抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究： Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合Ad-p53注射后腫瘤的生長(zhǎng)抑制率為54.23％，顯著高于單藥組(p＜0.01)。與對(duì)照組腫瘤細(xì)胞相比，兩種腺病毒分別有效抑制了APE1或提高了p53蛋白表達(dá)水平。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況顯示，聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡率為(15.48±2.95)％，顯著高于Ad5/F35-APE1siRNA組(6.85±1.11)％、Ad-p53組(8.23

11、±1.60)％以及對(duì)照組(3.06±1.35)％(p＜0.01)。 結(jié)論: 1.APE1蛋白在肝細(xì)胞中的表達(dá)異位及增強(qiáng)與HCC進(jìn)展密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)APE1表達(dá)時(shí)可作肝細(xì)胞早期癌變的指標(biāo)之一。 2.p53突變是HCC發(fā)生的高概率事件，在HCC組織中APE1異位表達(dá)與p53突變沒有相關(guān)性。APE1異位表達(dá)和p53突變可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有協(xié)同促進(jìn)作用，APE1和p53是肝癌治療潛在的分子靶點(diǎn)，具有重