葡萄糖和醛固酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)似乎參與嚙齒類動(dòng)物的心臟纖維化過(guò)程,表現(xiàn)為非上皮細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的改變,且在許多實(shí)驗(yàn)研究中高濃度葡萄糖同樣可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖。但高濃度葡萄糖和醛固酮對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的增殖是否具有協(xié)同作用,結(jié)論并不一致。因此本研究以新生SD大鼠的心臟成纖維細(xì)胞為模型,研究不同葡萄糖濃度和醛固酮對(duì)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響,為心臟纖維化的發(fā)生提供新的認(rèn)識(shí)。
　　 方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)

2、物:出生1-3d的SD大鼠,雌雄不限,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物動(dòng)中心。
　　 2心臟成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):無(wú)菌條件下取出生1-3天的SD大鼠心臟,胰蛋白酶消化心臟組織后取消化液,經(jīng)過(guò)濾、離心將所得細(xì)胞種植于含培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶放在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育40分鐘后,棄去上層培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞,所得細(xì)胞基本為成纖維細(xì)胞。更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),每隔一天換培養(yǎng)液.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí),以1×105/ml密度傳代,實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均

3、為第二代細(xì)胞。
　　 3免疫組織化學(xué)觀察:取24孔板,每孔內(nèi)放一片蓋玻片,將心臟成纖維細(xì)胞接種于孔內(nèi)蓋玻片上,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞充分附著貼壁后,取出蓋玻片用PBS液清洗兩遍,4％多聚甲醛固定,按免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶(ABC)法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色并于顯微鏡下觀察。
　　 4實(shí)驗(yàn)分組:將生長(zhǎng)狀態(tài)一致、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第二代細(xì)胞隨機(jī)分為九組:
　　 (1)低糖組(5.6 mmol/L

4、D-葡萄糖)
　　 (2)低糖+10-7mol/L醛固酮(Ald)組
　　 (3)低糖+10-7mol/L Ald+10-6mol/L螺內(nèi)酯(Spi)
　　 (4)高糖A組(15 mmol/L D-葡萄糖)
　　 (5)高糖A+10-7mol/L Ald組
　　 (6)高糖A+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 (7)高糖B組(25 mmol/L D-葡萄糖)

5、r>　　 (8)高糖B+10-7mol/L Ald組
　　 (9)高糖B+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 各組的培養(yǎng)液均為無(wú)血清等滲培養(yǎng)液。
　　 5 Brdu、WST-1 ELISA法同步測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞的DNA合成和代謝活性:
　　 將生長(zhǎng)良好的第一代細(xì)胞消化、收集、記數(shù),調(diào)整濃度后接種于96孔板,每孔5000-6000個(gè)細(xì)胞。37℃、5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24小

6、時(shí),棄去各孔培養(yǎng)液,以無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí),使細(xì)胞進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期。采用三種D-葡萄糖濃度培養(yǎng)液(5.6 mmol/L,15 mmol/L,25 mmol/L)、醛固酮(10-7mol/L)及螺內(nèi)酯(10-6 mol/L)干預(yù)24小時(shí),其中用L-葡萄糖調(diào)節(jié)三種培養(yǎng)液使其滲透壓相等。按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用WST-1、Brdu摻入法同步測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞的DNA合成和代謝活性。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

7、用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組與組之間分析采用多組均數(shù)的兩兩比較。交互作用采用兩因素方差分析,P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1心臟成纖維細(xì)胞的鑒定:免疫細(xì)胞化學(xué)染色,光鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或多角形,纖維連接蛋白染色呈陽(yáng)性,胞漿內(nèi)圍繞胞核呈現(xiàn)棕黃色細(xì)密顆粒,呈細(xì)絲狀,PBS對(duì)照呈陰性,符合成纖維細(xì)胞的染色特征。免疫組化抗波形蛋白、

8、纖維連接蛋白染色陽(yáng)性鑒定為所需的心肌成纖維細(xì)胞,純度達(dá)94％。
　　 2不同糖濃度對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響:WST-1和Brdu結(jié)果表明,與低糖組(5.6 mmol/L)比較,高糖組(15 mmol/L、25 mmol/L)細(xì)胞的代謝活性和DNA合成均顯著增高(P＜0.01)。但高糖兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3醛固酮在不同糖濃度時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響:WST-1和Brdu結(jié)果表明,與低糖組(5.6mmol/L)比

9、較,低糖+10-7mol/L醛固酮組細(xì)胞的代謝活性和DNA合成均明顯增高(WST-1,P＜0.01;Brdu,P=0.019)。但高糖(A、B)+10-7mol/L醛固酮組與對(duì)應(yīng)的高糖(A、B)組比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4螺內(nèi)酯對(duì)醛固酮刺激成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　 WST-1和Brdu結(jié)果表明,在不同糖濃度,與加醛固酮組比較,螺內(nèi)酯均能顯著抑制醛固酮引起的細(xì)胞代謝活性增強(qiáng)(P＜0.05),但對(duì)

10、DNA合成的抑制并不明顯(P＞0.05)。
　　 5糖和醛固酮對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的交互作用。
　　 WST-1和Brdu結(jié)果表明,不同糖濃度對(duì)成纖維細(xì)胞代謝活性和DNA合成的影響不同(P＜0.01);10-7mol/L醛固酮對(duì)成纖維細(xì)胞代謝活性的影響有顯著性差異(WST-1,P＜0.05),但其對(duì)成纖維細(xì)胞DNA合成的影響不明顯(Brdu,P＞0.05);兩者對(duì)成纖維細(xì)胞代謝活性的交互作用不明顯(WST-1,P=0.085