Th2-Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對人支氣管上皮細胞重塑的作用及其機制研究.pdf

1、背景:重癥哮喘是一種以CD4+T淋巴細胞中Th2和Th17細胞分化占優(yōu)勢及氣道重構(gòu)為特點的慢性炎癥性疾病。研究表明氣道重構(gòu)并非只是炎癥細胞參與的結(jié)果，一些非炎性細胞如氣道上皮細胞也扮演重要角色。在內(nèi)外環(huán)境中各種刺激下，氣道上皮細胞發(fā)生損傷、異常修復反應及細胞可塑性改變即通過“上皮重塑”來促進哮喘氣道重構(gòu)。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)是上皮重塑的典型表現(xiàn)之一，目前異常的EMT是哮喘氣道重構(gòu)機制研究的新熱點。在重癥哮喘患者氣道中Th2

2、和Th17源性細胞因子所介導的微環(huán)境對哮喘氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用尚不明確。因此探討這些因子對氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用及其分子機制，有助于揭示上皮重塑在重癥哮喘氣道重構(gòu)中的作用。在此基礎(chǔ)上探尋逆轉(zhuǎn)上皮重塑的可能途徑，具有重要的學術(shù)價值和臨床應用前景。
　　目的:研究IL-4/IL-17A介導的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮重塑的影響。并探討其信號轉(zhuǎn)導途徑及逆轉(zhuǎn)上皮重塑的可能途徑。
　　方法:
　　1.TGF-

3、β1、IL-4和IL-17A對氣道上皮細胞的增殖抑制作用:以人支氣管上皮細胞株16-HBE細胞為研究對象，采用CCK-8法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A對16-HBE細胞上清液中OD值的影響。
　　2.IL-4/IL-17A介導的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響:以16-HBE細胞為研究對象，使用光學顯微鏡觀察TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細胞的形態(tài)學變化;采用免疫細胞化學法

4、檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細胞中a-SMA蛋白表達水平的變化;采用RT-PCR、Western Blot方法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細胞中上皮-鈣粘蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌動蛋白(a-SMA) mRNA和蛋白表達水平的變化;采用ELISA法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細胞上清液中Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)表達水平的變化。

5、　　3.TGF-β1、IL-4和IL-17A在促氣道上皮EMT中的信號轉(zhuǎn)導通路研究:以16-HBE細胞為研究對象，采用Western Blot方法檢測不同時間點TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細胞中EGFR和p-EGFR、Smad3和p-Smad3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平的變化;使用U0126(ERK途徑拮抗劑)抑制TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所誘導的16-HBE細胞中ERK1/

6、2活化，采用RT-PCR、Western Blot方法觀察U0126在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用。
　　4.PPAR-γ激動劑抑制氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究:使用PPAR-γ激動劑羅格列酮(RGZ)干預TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所誘導的16-HBE細胞，采用RT-PCR、Western Blot探討羅格列酮對氣道上皮EMT的作用及可能機制。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β1、IL-4和IL-17A對氣道上皮

7、細胞的增殖抑制作用。
　　使用相應的刺激因子干預24小時，陽性對照組（含10％FCS的MEM培養(yǎng)液）能明顯促進16-HBE細胞OD值增高（1.1014±0.0529），陰性對照組（含1％FCS的MEM培養(yǎng)液）中16-HBE細胞OD值較低（0.4446±0.0317），兩者相比，在統(tǒng)計學上有明顯差異(P＜0.0001);單獨給予0、1、5、10、20ng/mlTGF-β1處理16-HBE細胞，細胞上清液OD值未見明顯變化（OD值:0

8、.4453±0.031，0.4445±0.0331，0.4358±0.032，0.4171±0.0264; P=0.198）;單獨給予0、1、5、10、20ng/ml IL-4刺激16-HBE細胞，細胞上清液OD值未見明顯變化(OD值:0.4399±0.0263，0.4381±0.0296，0.4491±0.0299，0.4398±0.0261;P=0.836);單獨給予0、1、5、10、20ng/ml IL-17A刺激16-HBE細胞

9、，隨著干預藥物濃度的增加，其OD值逐漸增高（OD值:0.4428±0.0324，0.4649±0.0199，0.5772±0.0592，0.6735±0.0558），各濃度組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.0001)，10或20ng/mlIL-17A可明顯促進16-HBE細胞的增殖，與0、1、5ng/ml比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而0、1、5ng/ml各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);給予10ng/mlTGF-β1、

10、IL-4和IL-17A共同刺激，所測得的OD值增高(OD:0.816±0.0559)，統(tǒng)計分析顯示與不同濃度的單個因子干預組(0、1、5、10、20)相比有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，提示給予TGF-β1、IL-4、IL-17A聯(lián)合刺激時，有協(xié)同作用，能明顯促進16-HBE細胞增殖。
　　2.IL-4/IL-17A介導的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮EMT的影響。
　　(1)在光學顯微鏡下，對照組細胞呈典型的上皮細

11、胞外觀即鵝卵石狀;單獨給予10ng/mlIL-4或IL-17A刺激72小時后，16-HBE細胞形態(tài)無明顯變化;單獨給予10ng/ml TGF-β1刺激后，16-HBE細胞形態(tài)由鵝卵石向梭狀、紡錘形轉(zhuǎn)變，細胞之間的連接變得松散，細胞間間隙增大。當多個因子聯(lián)合刺激時，IL-4+IL-17A未能誘導16-HBE細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化;TGF-β1+IL-4或TGF-β1+IL-17A一起作用時，可誘導16-HBE細胞發(fā)生類似TGF-β1組的變化

12、;而TGF-β1+IL-4+IL-17A一起作甩時較TGF-β1組細胞形態(tài)變化更加顯著。
　　(2)在正常氣道上皮細胞中a-SMA低表達，而發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的細胞中a-SMA表達增高。使用各干預因素作用72小時后，應用細胞免疫化學法觀察到空白組和對照組之間a-SMA表達（棕黃色顆粒）的平均灰度無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05);10ng/mlTGF-β1組與對照組比較，16-HBE細胞胞漿內(nèi)a-SMA表達（棕黃色顆粒）明顯增加，差異

13、具有顯著性(P＜0.05);10ng/mlIL-4組與對照組比較，a-SMA表達（棕黃色顆粒）輕度增加與正常對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);10ng/mlIL-17A處理的16-HBE細胞胞漿內(nèi)a-SMA表達（棕黃色顆粒）的平均灰度無明顯變化，與對照組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。當多個因子聯(lián)合刺激時，10ng/ml TGF-β1+IL-4或10ng/ml TGF-β1+IL-17A或10ng/ml IL-4+ IL-

14、17A處理的16-HBE細胞胞漿內(nèi)a-SMA表達（棕黃色顆粒）的平均灰度明顯增加，與正常對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);而10ng/ml TGF-β1+IL-4+IL-17A共同作用組與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);與其他作用組比較，a-SMA表達進一步增加，差異具有顯著性(P＜0.05)，提示TGF-β1、IL-4和IL-17A共同作用于16-HBE細胞，能進一步增強TGF-β1誘導16-HBE細胞發(fā)生EMT

15、的作用。
　　(3)使用各刺激因子干預24小時，RT-PCR結(jié)果顯示單個刺激因子作用時，10ng/mlTGF-β1組較對照組16-HBE細胞中E-cad mRNA表達水平降低，α-SMA mRNA表達水平增高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.10);與對照組比較，10ng/ml IL-4組沒有明顯影響16-HBE細胞中E-cad mRNA表達水平，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.577)，輕度促進α-SMA mRNA的表達，但差異無統(tǒng)計學

16、意義(P=0.082);10ng/mlIL-17A組較對照組16-HBE細胞中E-cad mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005);沒有影響α-SMA mRNA表達水平，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.577)。當多個因子聯(lián)合刺激時，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A可降低16-HBE細胞E-cad mRNA表達水平，差異有統(tǒng)計學意

17、義(P＜0.05);增加16-HBE細胞a-SMA mRNA表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三個因子共同刺激16-HBE細胞時，與其他任一干預因素相比，能進一步降低E-cad mRNA表達水平(P＜0.01);進一步增加a-SMA mRNA表達水平(P＜0.01)。
　　此外，RT-PCR的結(jié)果還顯示10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激，所誘導

18、16-HBE細胞EMT呈時間依賴性，隨著時間的延長（培養(yǎng)24h、48h、72h）E-cad mRNA的相對表達量逐漸降低，α-SMAmRNA的相對表達量隨著時間的延長逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05)。
　　使用刺激因子干預72小時，Western Blot結(jié)果顯示，單個刺激因子作用時，10ng/mlTGF-β1組較對照組16-HBE細胞E-cad蛋白表達水平降低，α-SMA蛋白表達水平增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05

19、);與對照組比較，10ng/mlIL-4組沒有影響16-HBE細胞E-cad蛋白表達水平，兩者間無統(tǒng)計學差異(P=0.68)，但增加α-SMA蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);10ng/mlIL-17A組較對照組16-HBE細胞中E-cad蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但沒有影響α-SMA蛋白表達水平，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.24)。當多個因子聯(lián)合刺激時，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1+I

20、L-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A均可降低16-HBE細胞E-cad蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，增加16-HBE細胞a-SMA蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);當10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三個因子共同刺激16-HBE細胞時，與其他干預因素相比，能進一步降低E-cad蛋白表達水平(P＜0.01)，進一步增加a-SMA蛋白表達水

21、平(P＜0.001)。
　　(4)使用刺激因子干預72小時，ELISA檢測結(jié)顯示單個刺激因子作用時，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1組或IL-4或IL-17A組均能促進16-HBE細胞培養(yǎng)上清液中PINP水平增高，不同干預組間存在統(tǒng)計學差異（均P＜0.001），其中TGF-β1作用最顯著(P＜0.001)。當多個因子聯(lián)合刺激時，與TGF-β1組相比，10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-1

22、7A或10ng/mlIL-4+IL-17A或10ng/mlTGF-β1+ IL-4+IL-17A均未能進一步增加16-HBE細胞培養(yǎng)上清液中PINP水平(P＜0.01)。
　　3.TGF-β1/IL-4/IL-17A在促氣道上皮EMT中的信號轉(zhuǎn)導通路研究。
　　(1)Western Blot結(jié)果表明TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1/IL-4/IL-17A聯(lián)合刺激均沒有影響EGFR、Smad3、ERK1/2的

23、基礎(chǔ)表達。使用刺激因子干預5或60分，與對照組比，TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均沒有影響p-EGFR/EGFR比值(P＞0.05);與對照組比，給予刺激5分鐘，TGF-β1能增高p-Smad3/Smad3比值(P=0.008)，給予刺激60分鐘，p-Smad3/Smad3比值進一步增高(P＜0.001)，而IL-4、IL-17A及TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激5或60分

24、鐘p-Smad3/Smad3比值無明顯變化(P＞0.05)。與對照組比，TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均能增高(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值，各組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，其中TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激對(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值的增高作用最顯著(p＜0.05);TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激對(p-ERK1/2)/

25、(ERK1/2)比值增加呈時間依賴性(P＜0.05)。
　　(2)Western Blot結(jié)果顯示20μM U0126明顯抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A共同作用所活化的ERK1/2信號通路(P=0.001)。U0126能恢復TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所降低的E-cad蛋白水平(P＜0.001)，降低其所誘導的a-SMA蛋白水平(P＜0.001)。這些結(jié)果說明TGF-β1，IL-4和IL-17A通過活化1

26、6-HBE細胞中的ERK1/2信號通路促進EMT。
　　4.PPAR-γ激動劑羅格列酮抑制氣道上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究。
　　(1)使用刺激因子干預72小時，RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，10μMRGZ自身不能影響16-HBE細胞中E-cad(P=0.788)和α-SMAmRNA的基礎(chǔ)水平(P=0.949);10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE細胞E-cad mRNA表達水平(P＜

27、0.001)，增加α-SMA mRNA表達水平(P＜0.001);與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組比，10μM RGZ能部分逆轉(zhuǎn)其作用，增加E-cad mRNA表達水平(P＜0.001)，降低α-SMA mRNA表達水平(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　使用刺激因子干預72小時，Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，10μM RGZ自身，不影響16-HBE細胞中E-cad(P=0.713)和α-

28、SMA蛋白的基礎(chǔ)水平(P=0.629);10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE細胞E-cad蛋白表達水平(P＜0.001)，增加α-SMA蛋白表達水平(P=0.001)。與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組比，10μM RGZ能增加E-cad蛋白表達水平(P＜0.001)，降低α-SMA蛋白表達水平(P=0.002)，差異有統(tǒng)計學意義，以上結(jié)果提示RGZ能逆轉(zhuǎn)TGF-β1、IL-4和I

29、L-17A共同刺激所誘導的16-HBE細胞EMT。
　　(2)Western Blot結(jié)果顯示10μM RGZ明顯抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A聯(lián)合作用所活化的ERK1/2信號通路(P=0.001)。與對照組相比，TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組降低16-HBE細胞中E-cad蛋白水平，增加α-SMA蛋白水平，與前文的結(jié)果類似，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺

30、激組比較，10μM RGZ，20μM U0126，10μM RGZ+20μM U0126能部分逆轉(zhuǎn)其作用，增加16-HBE細胞中E-cad蛋白表達水平，降低α-SMA蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);但三組間所產(chǎn)生的效應基本類似，三者間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)
　　結(jié)論:
　　(1) Th2源性因子IL-4、Th17源性因子IL-17A和致纖維化介質(zhì)TGF-β1共同作用的微環(huán)境能直接促進氣道上皮細胞增殖。