M2型巨噬細胞在小腸放射損傷修復(fù)中的作用和機制研究.pdf

1、放射治療是當今腫瘤治療的三大手段之一，在病人術(shù)前或是術(shù)后放療可以有效治愈腫瘤，減少腫瘤復(fù)發(fā)概率。但是腹部和盆腔腫瘤在放射治療過程中，放射性腸損傷是一重要的臨床問題。放射性腸損傷是由于腸上皮放射敏感性較高，受照小腸或是結(jié)直腸損傷誘發(fā)的腸道反應(yīng)，常常會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和營養(yǎng)吸收障礙，體重下降，甚至出現(xiàn)便血、腸梗阻、腸簍等病變，嚴重影響病人的生活質(zhì)量，不利于放療對腹盆腔腫瘤的控制。
　　哺乳類動物腸上皮是由單層柱狀上皮組成，主

2、要分為兩個不同部分：分化區(qū)和增生區(qū)，分化的上皮細胞主要存在于絨毛和上皮表面，增生上皮細胞主要位于隱窩，可以進一步的分為干細胞和TA細胞，TA細胞具有快速分化并轉(zhuǎn)移到增生區(qū)，干細胞又能及時補充TA細胞，因此在增生區(qū)連續(xù)不斷地分化會導(dǎo)致上皮細胞沿隱窩-絨毛軸方向移動，逐漸移動到分化區(qū)，并使上皮細胞分化為吸收細胞系（腸細胞）和分泌細胞系（杯狀細胞和內(nèi)分泌細胞）。所以認為腸上皮是由四種腸道上皮細胞系組成，它們都起源于干細胞，并且位于隱窩基底部的

3、干細胞在維持腸上皮平衡起到重要作用1-2。像是腸道感染、放射損傷和特發(fā)性腸炎等各種各樣疾病引起的腸上皮損傷就會造成上皮細胞的凋亡、上皮屏障的破壞3。上皮層受到損傷，就會逐步激活再生程序，隱窩干細胞增殖，并移動到分化區(qū)，使上皮層恢復(fù)連續(xù)緊密的結(jié)構(gòu)4。那么分化區(qū)凋亡的上皮距離隱窩干細胞甚遠，如何及時通知到干細胞呢？巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)的組成部分，在體內(nèi)最大的巨噬細胞群之一就是腸道巨噬細胞5，它們位于上皮屏障下方，參與腸道的免疫應(yīng)答，但目前

4、原代培養(yǎng)存在困難。Tanja等認為巨噬細胞這種免疫應(yīng)答激活不僅僅是由于外來物質(zhì)的刺激，還有上皮參與，所以他們進行了巨噬細胞與上皮細胞的共培養(yǎng)，但是在共培養(yǎng)的第7天發(fā)現(xiàn)只有少量巨噬細胞存活; Hiroki等人研究巨噬細胞與上皮細胞之間相互傳遞信號的機制，試通過體外培養(yǎng)Caco-2與THP-1，并沒有首選體內(nèi)腸巨噬細胞。
　　成熟的巨噬細胞在主要是來源于骨髓，隨著外周血液循環(huán)到達組織，組織的微環(huán)境可使巨噬細胞發(fā)生極化。目前巨噬細胞極化

5、類型主要分為兩種：M1型主要是參與免疫應(yīng)答，吞噬有害微生物等，產(chǎn)生炎癥因子IL-6、NO等，提高機體的防御，抵御有害物質(zhì)侵襲；M2型主要是在損傷組織中通過分泌抗炎因子參與修復(fù)與重塑，減輕機體炎癥反應(yīng)。
　　鑒于此，本論文首先對腸道自身的巨噬細胞進行了極型鑒定，在體外模擬凋亡腸道上皮細胞誘導(dǎo)Raw264.7細胞極化，探索這種巨噬細胞對隱窩腸道干細胞的作用和機制，為放射損傷的小腸修復(fù)提供理論依據(jù)。
　　一、小鼠小腸內(nèi)巨噬細胞極型

6、和在放射損傷中的作用
　　目的：腸道巨噬細胞在放射損傷中的作用
　　方法：通過對對照組和2Gy、8Gy照射組照后72小時和96小時C57BL/6小鼠腸細胞的分離及利用流式細胞分選技術(shù)，得到小鼠腸道巨噬細胞；對小鼠腸道巨噬細胞抽提RNA，以IL-10和iNOS基因作為分型標志物，進行實時熒光定量PCR檢測，以確定照射前后巨噬細胞極型；正常C57BL/6小鼠在第1天、5天、7天和9天分別經(jīng)腹腔注射200μl Clodronate

7、脂質(zhì)體、PBS脂質(zhì)體部分祛除小鼠腸道巨噬細胞，第8天和第11天進行流式細胞術(shù)分析小鼠胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓CD68+細胞選取最佳祛除巨噬細胞的時間點；對照組與照射組小鼠均分別給予Clodronate脂質(zhì)體和PBS脂質(zhì)體，第8天小鼠進行8Gy的全身照射并在照后72小時、96小時采腸道標本，進行 CD68、Claudin5免疫組織化學染色、HE染色、腸上皮核間距分析觀察小鼠腸道的放射損傷情況。
　　結(jié)果：對照組小鼠腸道巨噬細胞百

8、分數(shù)是59.2％、60.6%、60.3%，2Gy照后72小時細胞百分數(shù)25.8%、33.7%、30.8%，巨噬細胞開始下降；96小時細胞百分數(shù)49.9%、44%、42.1%，逐漸恢復(fù)；8Gy照后72小時細胞百分數(shù)40.9%、36%、42.9%，96小時細胞百分數(shù)40.2%、40.5%、39.3%，未見明顯恢復(fù)；RT-PCR結(jié)果表明對照組和照射組小鼠腸道的巨噬細胞均存在M2型巨噬細胞；小鼠腹腔注射 Clodronate脂質(zhì)體和PBS，發(fā)現(xiàn)

9、小鼠體內(nèi)胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓細胞巨噬細胞在給藥后的第8天CD68陽性細胞數(shù)量開始下降，在第11天進一步下降，后期恢復(fù)到第8天水平，因此選取給藥后第11天作為祛除小鼠體內(nèi)巨噬細胞效果最佳時間點；病理分析顯示在給予小鼠8Gy照射后，巨噬細胞減少的小鼠腸道損傷較對照組更為明顯；核間距分析結(jié)果表明8Gy照射后72h對照組上皮細胞核排列較對照組排列較為紊亂，Clodronate脂質(zhì)體組上皮細胞核排列更加紊亂，核間距增大，出現(xiàn)核固縮壞死；9

10、6h對照組上皮逐漸開始恢復(fù)，增生，核排列較72 h緊密，形態(tài)相對完整，96hClodronate脂質(zhì)體組上皮損傷更為嚴重，核間距進一步增加；Claudin5結(jié)果顯示8Gy照射后72h對照組與Clodronate脂質(zhì)體組均存在部分屏障損傷，未見明顯差異，96h對照組部分損傷，Clodronate脂質(zhì)體組腸道組織大體存在明顯損傷，其損傷程度明顯高于對照組。
　　結(jié)論：在小鼠腸道內(nèi)巨噬細胞是以M2型存在，而且在照射后極型不改變，并在腸道

11、放射性損傷中起保護作用。
　　二、體外誘導(dǎo)M2巨噬細胞促進Lgr5腸道干細胞增殖
　　目的：腸道巨噬細胞發(fā)揮作用的機制
　　方法：對 CT26小鼠結(jié)腸癌細胞進行6Gy和15Gy照射并用流式細胞儀通過磷脂酰絲氨酸外翻法檢測細胞凋亡；用凋亡細胞上清液對RAW264.7小鼠巨噬細胞細胞進行體外極化誘導(dǎo)分型，通過Elisa分析IL-10與IL-12的變化確定細胞體外極化誘導(dǎo)后的極型；利用Lgr5-EGFP-IRES-creER

12、T2小鼠進行Lgr5腸道干細胞的分離與培養(yǎng)；將體外誘導(dǎo)極化的RAW264.7巨噬細胞與 Lgr5腸道干細胞進行細胞共培養(yǎng)或Transwell培養(yǎng)，通過多功能酶標儀檢測GFP熒光強度。
　　結(jié)果： CT26細胞在15Gy照射條件下在72小時凋亡細胞率達到66.9%；RAW264.7細胞在凋亡上清液的作用三天后細胞IL-10表達上調(diào)以及IL-12表達下調(diào)，證實RAW264.7發(fā)生極化成為M2型巨噬細胞；Lgr5+腸道干細胞在分別缺少N

13、oggin、EGF、R-spondin干細胞生長因子的條件下與對照組RAW264.7、M2型RAW264.7分別共培養(yǎng)，表明M2型巨噬細胞可以分泌EGF因子，代替培養(yǎng)基中的EGF，促進干細胞的生長增殖。
　　結(jié)論： M2型巨噬細胞通過分泌EGF促進Lgr5+腸道隱窩干細胞的生長增殖。
　　綜上所述表明腸道中存在M2型巨噬細胞，這種極型不因照射而改變，并且通過分泌EGF因子，促進腸道隱窩干細胞Lgr5生長增殖。腸道中M2型巨噬