狂犬病毒糖蛋白衍生肽引導雙報告蛋白靶腦轉(zhuǎn)運的研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等嚴重影響人們的生活質(zhì)量，給社會、家庭帶來沉重負擔。將具有治療作用的物質(zhì)輸送至腦部、對腦部疾病進行有效地治療，一直是人們期待的目標。然而，由于血腦屏障(BBB)的存在，許多有潛在治療價值的大分子物質(zhì)難以進入腦內(nèi)。將這些大分子治療物質(zhì)透過BBB、靶向轉(zhuǎn)運入腦，一直是人們不懈探索的目標。目前，開發(fā)靶腦載體是解決這個難題的有效途徑，將具有治療功能的物質(zhì)通過分子克隆的方法，與靶腦載體連接，在細胞

2、中表達形成融合蛋白，在載體的協(xié)助作用下，可實現(xiàn)大分子物質(zhì)的靶腦轉(zhuǎn)運。
　　 狂犬病毒糖蛋白(RVG)是一種嗜神經(jīng)性的蛋白質(zhì)，能夠攜帶其它物質(zhì)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運、促進其他病毒轉(zhuǎn)運到腦中，已證實位于第189～214位和第330～357位的肽段具有嗜神經(jīng)性，這些肽段是RVG與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，將這些肽段進行改造，可得到靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)、無免疫原性的RVG衍生肽段(RDP)，這種衍生肽保留了RVG的嗜神經(jīng)性，具有將外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運入腦的潛

3、在功能。將189-214位與第330-327位多肽片段的基因序列進行改造，并分別命名為RDP189與RDP330，本實驗室為了驗證RDP的靶腦轉(zhuǎn)運大分子蛋白的功能，將RDP189和RDP330的核苷酸片段與雙報告基因egfp和lacz的核苷酸片段重組，用RDP攜帶大分子雙報告蛋白β-半乳糖苷酶(β-GAL)和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)入腦轉(zhuǎn)運，同時構(gòu)建沒有RDP序列的egfp和lacz重組質(zhì)粒，作為對照，探究RDP的入腦轉(zhuǎn)運能力。<

4、br>　　 通過分子克隆方法，將載體RDP核苷酸序列與β-GAL和 EGFP的核苷酸序列重組，獲得重組質(zhì)粒pET28(+)-RDP-EGFP-LacZ，同時構(gòu)建沒有RDP的β-GAL和EGFP的核苷酸重組質(zhì)粒pET28(+)-EGFP-LacZ，作為對照。獲得陽性克隆后，大腸桿菌體內(nèi)，在25℃，6h，IPTG：1.0mM的條件下進行蛋白誘導表達，超聲破碎的方法，獲得目的蛋白，融合蛋白均為可溶性表達，無須包涵體處理。Lorry法測定總蛋

5、白含量，通過尾靜脈注射方法注射入小鼠體內(nèi)。小鼠實驗分為三組，實驗組，注射有RDP引導的EGFP和β-GAL融合蛋白，對照組，注射沒有RDP引導的EGFP和β-GAL融合蛋白，空白組，不作處理。15min、8h后分別處死小鼠，取組織，固定、脫水、切片，通過熒光顯微鏡和X-gal染色分別檢測EGFP和β-GAL。實驗結(jié)果顯示，實驗組，在大腦皮層的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和海馬區(qū)的神經(jīng)元以及脊髓灰質(zhì)中，分別檢測到蛋白的分布，外周組織中，除了腎臟和肝臟，其

6、他外周組織蛋白的分布與空白組相似；對照組，僅在腎臟和肝臟中檢測到蛋白的分布，其他各組織蛋白發(fā)布與空白組相似。另外，在實驗組和對照組的腎臟和肝臟中均檢測到蛋白的分布，原因是這兩個器官是主要的排泄和解毒器官，一部分蛋白可能通過這兩個器官排泄排出體外。此外，蛋白注射小鼠體內(nèi)15min后，便能在腦部檢測到蛋白的分布，并且含量較高，說明轉(zhuǎn)運速率非常快，提示融合蛋白轉(zhuǎn)運的可能機制是通過受體介導的胞吞作用實現(xiàn)的。8h后，在實驗組基本上檢測不到蛋白，說