硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的多態(tài)性及血液透析對(duì)其活性的影響.pdf

1、該課題研究了河南地區(qū)漢族人TPMT的多態(tài)性和部分等待腎移植的尿毒癥病人TPMT的基因型、表型及血液透析對(duì)TPMT活性的影響,以期為尿毒癥病人腎移植術(shù)后免疫抑制劑的個(gè)體化用藥提供臨床治療依據(jù).方法:1 TPMT基因型分析健康志愿者140例,互無親緣關(guān)系,河南地區(qū)漢族人,均為本校學(xué)生,男96例,女44例,平均年齡22.1±1.2歲,4個(gè)月內(nèi)無輸血史、疾病史、外傷史、服藥史;30例慢性尿毒癥患者,男性16例,女性14例,平均年齡32±9.6

2、5歲,采血前一個(gè)月未輸注紅細(xì)胞.SDS-蛋白酶K-酚-氯仿法提取基因組DNA,采用等位基因特異性的PCR(allele specific PCR,ASPCR)檢測(cè)TPMT<'*>1和TPMT<'*>2,限制性片段長度多態(tài)性-PCR(restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分別檢測(cè)TPMT<'*>3A、TPMT<'*>3B和TPMT<'*>3C.2 TPMT表型分析 2.1 血標(biāo)

3、本處理 在已確定TPMT基因型的健康志愿者中篩選30例,其中TPMT<'*>1型28例,TPMT<'*>3C型2例;30例尿毒癥患者均為TPMT<'*>1型.健康志愿者和尿毒癥患者血液透析前及透析后4小時(shí)各抽取肘靜脈血5ml,血樣置于肝素鋰管中抗凝后,6小時(shí)內(nèi)低溫離心分離紅細(xì)胞,生理鹽水洗滌兩遍,離心棄上清,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(用生理鹽水稀釋至4×10<'9>cells/ml),加入4倍冷蒸餾水裂解紅細(xì)胞,離心后取上層透明液,置于-20℃保存.

4、2.2 酶活性的測(cè)定 采用改良的高效液相色譜法測(cè)定紅細(xì)胞TPMT活性,用37℃每小時(shí)內(nèi)每毫升紅細(xì)胞催化生成1納摩爾6-MMP來表示TPMT酶的1個(gè)活性單位.取樣品解凍后,加入Chelex 100 4 ℃振蕩1h后離心,取上清.每1ml上清加入150μl(0.3M,pH 7.5)的磷酸鹽緩沖液,80μl別嘌呤醇(終濃度58μM),30μl二硫蘇糖醇(終濃度1090μM),20μl S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-Lmetion