創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)源性機制及其干預實驗研究.pdf

1、研究背景
　　創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是致死致殘率很高的一種常見病。除原發(fā)性腦損傷外，繼發(fā)性腦損傷對TBI的預后也起著重要影響。目前有關(guān)TBI的發(fā)生發(fā)展機理至今尚未完全明確，國內(nèi)外有多種學說，如：血腦屏障學說，鈣通道學說，自由基學說，腦微循環(huán)學說，能量代謝學說等。但上述學說沒有一種能完全解釋清TBI發(fā)病機理，這是因為創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生機理是十分復雜的。上述的各種機制并非孤立存在、單獨起作用，而是相互影響、多種機制共同起作用的結(jié)果。近

2、年來，神經(jīng)源性炎癥在TBI中的作用機制逐漸引起人們的重視，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽Y（NPY）、降鈣素相關(guān)基因肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）、水通道蛋白-4（AQP4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等在TBI后神經(jīng)源性炎癥中扮演重要角色。本課題提出“創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機制”假說，正是基于神經(jīng)源性炎癥。假說主要內(nèi)容：TBI后，腦組織內(nèi)許多神經(jīng)化學和細胞介質(zhì)發(fā)生改變，并且組織內(nèi)發(fā)生類似神經(jīng)源性炎癥反應或者/和疼痛作為應激性刺激通過復

3、雜的神經(jīng)源性機制誘發(fā)的腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常，導致或者加劇腦組織內(nèi)生物學活性物質(zhì)產(chǎn)生與代謝失衡，引起腦細胞的損傷，從而加劇損傷區(qū)腦組織的損傷，并且引起損傷區(qū)周圍腦組織的損傷反應，引發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫，造成繼發(fā)性顱腦損害，即①神經(jīng)源性炎癥或損傷刺激直接或經(jīng)傳導作用于腦細胞→胞體分泌神經(jīng)肽增加→神經(jīng)突觸間神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多→離子通道活動增加→動作電位活動增加，并由突觸部位擴散到胞體→胞體鈉、鈣通道活動增加→導致水鈉儲留，鈣超載→細胞性腦水腫。②

4、神經(jīng)源性炎癥產(chǎn)生的生物學活性物質(zhì)（如SP）作用于腦血管及水通道-4（AQP4）→AQP4活動增強（在朝向血管面及軟腦膜面的膠質(zhì)細胞膜區(qū)有選擇性的高表達），腦血管通透性增加，膠質(zhì)細胞水腫→血腦屏障（BBB）通透性增加，血管內(nèi)容滲出增多，間隙性水腫→血管源性腦水腫。①②共同導致創(chuàng)傷性腦水腫，引起顱內(nèi)高壓，此時如不采取措施（脫水、激素、手術(shù)）阻止其發(fā)展，那將會有更多的腦細胞死亡，炎癥加劇，水腫加重，形成惡性循環(huán)，直至腦疝死亡。如果上述假設(shè)成立

5、，通過干預或阻斷上述環(huán)節(jié)均可能減輕組織損傷，這為我們尋找開發(fā)新藥治療創(chuàng)傷性腦損傷提供了新的思路。
　　研究目的：
　　1、探討創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機制，即顱腦創(chuàng)傷導致創(chuàng)傷性腦水腫引起腦組織損傷性改變的具體機制。（第一部分實驗要解決的問題）
　　2、探討使用各種受體拮抗劑，能否減輕和抑制上述損傷性改變。（第二部分實驗要解決的問題）
　　研究方法：
　　1.第一部分實驗，采用Wistar雄性大鼠40只，體重2

6、80±10g，隨機分為4組：對照組（C組），輕度創(chuàng)傷組（M1組），中度創(chuàng)傷(M2組),重度創(chuàng)傷組（S組），以上4組每組10只。用Feeney按自由落體致傷原理制作TBI大鼠模型，傷后記錄丘腦腹后內(nèi)側(cè)核（VPM）痛敏神經(jīng)元（PSN）放電頻率，1h后斷頭取血，開顱取腦。通過肉眼大體觀測各組大鼠腦皮層損傷處及其周邊腦組織損傷程度；光鏡蘇木精—伊紅染色法(HE)從組織細胞水平觀測大鼠腦組織損傷程度;透射電鏡超微結(jié)構(gòu)水平觀測大鼠腦皮層損傷處及其周

7、邊腦組織損傷程度;免疫組化檢測大鼠腦皮層損傷處及其周邊腦細胞中SP、NPY、CGRP、NF-κB、AQP4陽性表達情況;Westernblot檢測大腦皮質(zhì)損傷區(qū)AQP4蛋白表達情況;RT-PCR檢測SP、NPY、CGRP、NF-κB、NSE和AQP-4基因表達水平;ELISA法測定血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、緩激肽（BK）、前列腺素E2（PGE2）、組織胺（HA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）、高敏C反應蛋白（hs-CRP）含

8、量;激光共聚焦熒光離子成像實驗測定腦細胞內(nèi)Ca++濃度，檢測鈣超載情況;流式細胞儀檢測大鼠腦皮層細胞亞二倍體比率，了解腦細胞凋亡情況;多通道電生理記錄儀記錄分析VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率。對上述各項指標進行統(tǒng)計學分析，做相關(guān)性研究。從組織形態(tài)學、蛋白學、基因?qū)W、血清學、神經(jīng)電生理學、超微結(jié)構(gòu)多角度研究創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機制。
　　2．第二部分第一章干預實驗--NK1受體拮抗劑L-703,606對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷保護作用機制的實

9、驗研究，采用45只Wistar雄性大鼠，體重280±10g，隨機分為3組：對照組（C組），L-703,606干預組（L組），TBI創(chuàng)傷未干預組(T組),以上3組每組15只。TBI造模成功后立即尾靜脈給予NK1受體拮抗劑L-703,606(250nmol/kgSigma公司),然后于造模后1h斷頭取血，開顱取腦，HE染色觀察各組鼠腦損傷情況；免疫組化染色檢測SP、CGRP、NF-κB表達情況；RT-PCR檢測SP、CGRP、NF-κB、N

10、SE、AQP4mRNA基因表達；ELISA法測定血清中NSE、hs-CRP；統(tǒng)計學分析上述指標，研究P物質(zhì)受體-NK1受體拮抗劑L-703,606干預效果。
　　3.第二部分第二章干預實驗--Rho激酶抑制劑對創(chuàng)傷性腦損傷后腦細胞內(nèi)亞二倍體比率的影響及其意義，采用健康成年雄性Wistar大鼠45只，體重280±10g,隨機分為3組，即假手術(shù)組（Sham組），創(chuàng)傷組（TBI組）和Rho激酶抑制劑干預組（FSD組），每組15只。造模后

11、采用流式細胞儀（FCM)檢測鼠腦創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞亞二倍體比率，了解使用Rho激酶抑制劑（Fasudil）后使TBI細胞凋亡改善情況。
　　研究結(jié)果
　　1．第一部分實驗結(jié)果顯示，隨打擊程度加重，鼠腦水腫越明顯、腦細胞、線粒體腫脹越明顯，并可見神經(jīng)突觸間釋放神經(jīng)遞質(zhì)及炎癥細胞浸潤；SP、NPY、CGRP、NF-κB、AQP4、NSE基因表達與蛋白陽性表達成正相關(guān)性，且損傷越重，基因表達越強，其對應的陽性蛋白含量表達也越多;致痛物

12、質(zhì)BK、PGE2、HA與致痛致炎神經(jīng)遞質(zhì)-SP基因蛋白表達水平成正相關(guān)；SP與VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率成正相關(guān)性，致痛物質(zhì)-P物質(zhì)表達含量越高，VPM核痛敏神經(jīng)元放電頻率越高；SP與神經(jīng)肽-NPY、CGRP之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達及釋放越多，神經(jīng)肽NPY和CGRP表達越多；SP與炎癥因子-核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-κB)及炎癥反應指標-高敏感性C反應蛋白（hs-CRP）之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達及釋放越多，炎癥反應指標hs-CRP和NF

13、-κB表達越高，炎癥反應越嚴重，NF-κB與hs-CRP之間也呈正相關(guān)性，NF-κB表達越多，血清hs-CRP含量越高，炎癥反應越重；SP與基質(zhì)蛋白水解酶9(MMP-9)、水通道蛋白AQP4表達之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達及釋放越多，MMP-9含量增多，降解和破壞血管內(nèi)皮基膜的能力越強，引起血管通透性增加，炎性物質(zhì)滲出增多，導致血管源性腦水腫,P物質(zhì)表達越多可引起AQP4表達也增多，引起細胞膜通透性增高，導致細胞性腦水腫;SP與損傷皮層腦

14、細胞鈣離子含量及細胞凋亡指標-亞二倍體（Hd）比率之間成正相關(guān)性，P物質(zhì)表達及釋放越多，損傷皮層腦細胞鈣離子含量越高（鈣超載現(xiàn)象越嚴重），腦細胞亞二倍體（Hd）比率也越高（細胞凋亡越嚴重）；SP與神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）之間成正相關(guān)，P物質(zhì)表達越多，炎癥反應越嚴重，神經(jīng)細胞壞死越多，NSE表達及含量也越高;NPY、CGRP與NF-κB之間成正相關(guān)性，TBI后NPY、CGRP表達越高，NF-κB表達也越高，炎癥反應也越重；NF-κB

15、與NSE、AQP4、鈣離子濃度、亞二倍體（Hd）比率之間成正相關(guān)性，TBI后NF-κB表達越高，炎癥反應越重，NSE(反映神經(jīng)細胞損傷)、AQP4（反映細胞性腦水腫）、鈣離子濃度（反映鈣超載）和亞二倍體（反映腦細胞凋亡）比率也越高。（P均﹤0.05）
　　2.第二部分L-703,606對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷保護作用機制的實驗研究，結(jié)果顯示L-703,606干預組（L組）明顯較TBI未干預組（T組）損傷減輕，僅有輕度充血，少量炎性細胞浸

16、潤;L組和T組大鼠腦皮層損傷區(qū)腦組織SP、CGRP和NF-κB陽性表達較對照組陽性表達有明顯增強（P﹤0.05），L組較T組表達明顯降低；L組和T組大鼠腦皮層損傷區(qū)腦組織SP、CGRP、NF-κB、AQP-4和NSE基因表達水平較對照組陽性表達有明顯增強（P﹤0.05），且L組較T組表達明顯降低（P﹤0.05）；L組和T組大鼠血清中hs-CRP和NSE含量較對照組明顯增高（P﹤0.05），且L組較T組hs-CRP和NSE含量明顯降低。<

17、br>　　3.第二部分Rho激酶抑制劑對創(chuàng)傷性腦損傷后腦細胞內(nèi)亞二倍體比率的影響及其意義實驗研究結(jié)果顯示，Sham組、TBI組和FSD組的創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞亞二倍體比率（％）分別為1.58±0.35，15.90±3.91和5.35±2.10，三組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且FSD組能較TBI組明顯降低腦細胞內(nèi)亞二倍體比率，因而可減輕TBI后腦細胞凋亡，具有腦保護作用。
　　結(jié)論
　　1．神經(jīng)源性炎癥、神經(jīng)源性機制在創(chuàng)傷

18、性腦損傷中發(fā)揮重要作用；
　　2.NK1受體拮抗劑L-703,606對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷具有保護作用；
　　3.Rho激酶抑制劑（Fasudil）能降低腦細胞內(nèi)亞二倍體比率，對TBI后腦組織具有保護作用；
　　4.其他受體拮抗劑，如CGRP拮抗劑CGRP8-37、NPY拮抗劑BIBP3226,芬太尼痛覺干預,PDTC干預NF-κB,小劑量多巴胺抑制APQ4表達，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）