膠質(zhì)瘤相關(guān)基因Taqman低密度表達(dá)譜芯片及DNA甲基化研究.pdf

1、研究背景： 繼人類基因組計(jì)劃圓滿完成之后，“人類基因組外遺傳計(jì)劃”正式啟動(dòng)。大部分情況下，人類疾病有半數(shù)原因與基因遺傳有關(guān)，另一半則取決于基因組外遺傳變化?；蚪M外遺傳變化被認(rèn)為是控制基因活動(dòng)的“開(kāi)關(guān)”。甲基化作為基因組外遺傳機(jī)制的重要組成部分，是聯(lián)系基因遺傳、環(huán)境因素和疾病發(fā)生的重要紐帶。發(fā)現(xiàn)并分析人類基因的甲基化狀態(tài)，將有助于癌癥診治、甚至在基因變異之前即可預(yù)測(cè)是否有癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)。目前，腫瘤的甲基化研究是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，

2、但在膠質(zhì)瘤中的研究相對(duì)較少。 研究目的： 研究基因功能異常的兩大類機(jī)制：遺傳學(xué)機(jī)制和表遺傳學(xué)機(jī)制中代表性的研究領(lǐng)域： 1．在遺傳學(xué)機(jī)制中，通過(guò)Taqman低密度表達(dá)譜信息分析，從DNA損傷修復(fù)基因中選擇5個(gè)主要DNA損傷修復(fù)通路的27個(gè)代表性基因，探討膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)特征與臨床資料之間的內(nèi)在聯(lián)系與規(guī)律，高通量、系統(tǒng)的研究可為膠質(zhì)瘤臨床診斷、判斷預(yù)后等提供更多、更準(zhǔn)確的理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

3、 2．在表遺傳學(xué)機(jī)制中，研究腫瘤抑制基因在膠質(zhì)瘤中的啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和mRNA表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析甲基化發(fā)生與mRNA表達(dá)變化的內(nèi)在因果聯(lián)系及其與臨床情況之間的關(guān)系。初步探討去甲基化藥物對(duì)腫瘤抑制基因甲基化和mRNA表達(dá)的影響以及對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，為去甲基化藥物臨床用于膠質(zhì)瘤的靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)。研究方法： 1．臨床收集88例原發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHO分級(jí)：Ⅱ級(jí)23例，Ⅲ級(jí)20例，Ⅳ級(jí)45例)和10例正常腦組織標(biāo)本。

4、所有病人術(shù)后均進(jìn)行5年隨訪。2．網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)內(nèi)參基因GAPDH和27個(gè)DNA損傷修復(fù)基因：直接修復(fù)基因(MGMT)，堿基切除修復(fù)基因(MPG、MUTYH、NTHLl、OGGl、SMUGl、UNG、XRCCl)，核苷酸切除修復(fù)基因(ERCC1、ERCC2、．ERCC3、ERCC4、NUDTl)，錯(cuò)配修復(fù)基因(MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS2)和雙鏈斷裂修復(fù)(MREllA、MUS81、RAD50、RAD51、RAD

5、52、XRCC3、XRCC4、XRCC5)五個(gè)損傷修復(fù)通路的基因引物和探針，定制微流卡(Micro Fluidic Card，MFC)。3．使用Taqman低密度表達(dá)譜芯片技術(shù)，于7900HT熒光定量PCR儀上對(duì)其中40例不同病理級(jí)別原發(fā)膠質(zhì)瘤組織(Ⅱ級(jí)10例、Ⅲ級(jí)lO例、Ⅳ級(jí)20例)和10例正常腦組織實(shí)時(shí)、定量PCR檢測(cè)27個(gè)選定的DNA損傷修復(fù)基因以及內(nèi)參基因mRNA表達(dá)情況，并用SDS2.2圖像分析軟件進(jìn)行處理，通過(guò)ACt法和2<

6、'-A△△Ct>法兩種分析方法對(duì)最后的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4．結(jié)合臨床資料分析27個(gè)相關(guān)DNA損傷修復(fù)基因在其中40例不同病理級(jí)別原發(fā)膠質(zhì)瘤組織和10例正常腦組織中的mRNA表達(dá)情況及各基因在不同性別組和不同年齡組中的表達(dá)差異。5．結(jié)合病人的術(shù)后生存時(shí)間，采用：Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗(yàn)比較分析不同基因的mRNA表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。 6．甲基化特異性PCR(methylation spec

7、ific PCR，MSP)方法，檢測(cè)LATSl、LATS2、PCDH-γ/-A11、SLC5A8和TMSl/ASC等5個(gè)腫瘤抑制基因在88例膠質(zhì)瘤組織、10例正常腦組織的DNA甲基化情況。7．傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和SYBGreen實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)方法，檢測(cè)5個(gè)基因在其中30例膠質(zhì)瘤(Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ10例，Ⅳ10例)和10例正常腦組織中的mRNA表達(dá)情況，分析5個(gè)基因DNA甲基化發(fā)生率與其m

8、RNA表達(dá)水平之間及與臨床資料之間的關(guān)系。8．甲基化抑制劑5．氮雜脫氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)處理兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和SHG-44 72h前后，RT-PCR和MSP檢測(cè)5個(gè)基因的表達(dá)和甲基化狀態(tài)的變化。通過(guò)PI染色，采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)5-Aza-dC作用U251和SHG-44細(xì)胞株不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果： 1.2△△<'C

9、t>分析方法結(jié)果表明，27個(gè)DNA損傷修復(fù)基因中與正常腦組織相比有13個(gè)DNA損傷修復(fù)基因在Ⅱ級(jí)，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中均表達(dá)下調(diào)，包括ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLH1、MLH3、NTHL1、OGG1、RAD50、SMUG1、XRCC4、XRCC5(P<0.01)。在13個(gè)DNA損傷修復(fù)基因中，MLH3基因在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)低于Ⅱ級(jí)中的表達(dá)，并有顯著差異(P<0.01)；XRCC4基因在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

10、低于Ⅱ級(jí)中的表達(dá)，并有顯著差異（P<0.01)。其余14個(gè)基因中，MSH2、MSH6、NUDT1和XRCC3基因只在Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中下調(diào)(P<0.01)；MRE11A和MUSS1基因只在Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；PMS2、RAD52和XRCC1基因只在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；UNG基因只在Ⅱ級(jí)中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。MPG、MSH3、MUTHY和RAD51在正常腦組織、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

11、均無(wú)明顯差異(P>0.05)。 2.27個(gè)DNA損傷修復(fù)基因在29例男性膠質(zhì)瘤患者和11例女性膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)；其在<40、40-60和>60歲三個(gè)年齡組中的表達(dá)也均無(wú)明顯差異(P>0.05)。 3.在27個(gè)DNA損傷修復(fù)基因中，ERCC3、ERCC4、MLH3、MRE11A、NTHL1、RAD50、XRCC4和XRCC5基因表達(dá)下調(diào)與預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。 4.在88例膠質(zhì)瘤中，

12、LATS1、LATS2、PCDH-γ-All、SLC5A8和TMS1.ASC等5個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為63.66﹪、71.50﹪、86.36﹪、70.45﹪和57.95﹪；而在10例正常腦組織中均未檢測(cè)到LATS1、LATS2、SLC5A8和TMS1.ASC等4個(gè)基因的甲基化發(fā)生，PCDH-γ-All基因甲基化率亦僅為20﹪。5個(gè)基因的甲基化率在Ⅱ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中與正常腦組織比較均有顯著差異(P<0.05)，在不同病理級(jí)別間部分

13、存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中SLC5A8基因在Ⅳ級(jí)和Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中的DNA甲基化率比較有顯著性差異(p<0.05)。LATS1、LATS2和PCDH-γ-All基因的甲基化率在兩性別組間以及在不同年齡組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；SLC5A8和TMS1.ASC基因在<40與>60歲、40-60歲與>60歲年齡組間的甲基化率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5．LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS

14、1/ASC基因在Ⅱ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的mRNA表達(dá)與正常腦組織相比均明顯下調(diào)(P<0.05)，在不同病理級(jí)別間部分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，SLC5A8的mRNA表達(dá)在Ⅱ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中、TMS1/ASC的mRNA表達(dá)在Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)及Ⅱ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均有顯著差異(P<0.05)。LATS1、LATS2和PCDH-γ-A11基因的mRNA表達(dá)在兩性別組間以及在不同年齡組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；SLC5A8的mRNA表達(dá)在不同年齡

15、組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但TMSl/ASC的mRNA表達(dá)只在年齡<40歲和年齡>60歲組及40歲<年齡<60歲和>60歲組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 6．LATS1、LATS2、PCDH-7-A11、SLC5A8和TMSl/ASC基因中各基因發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤樣本中的mRNA的表達(dá)水平，明顯低于該基因未發(fā)生甲基化的膠質(zhì)瘤樣本(P<0.05)。 7．U251和SHG-44細(xì)胞株中均檢測(cè)到LATS1

16、、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1/ASC基因的甲基化。5μM的5-Aza-dC處理72h可誘導(dǎo)5個(gè)基因部分去甲基化，重新激活并顯著上調(diào)其mRNA的表達(dá)。5gM的5-Aza-dC作用于U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株24h、48h和72h后的細(xì)胞凋亡率分別為8.99﹪、24.40﹪和46.75﹪，作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株24h、48h和72h后的細(xì)胞凋亡率分別為13.85﹪、32.35﹪和62.50﹪，均大于同期DMS

17、O對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率。 研究結(jié)論： 1．ERCCl、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLHl、MLH3、NTHLl、0GGl、RAD50、SMUGl、XRCC4、XRCC5等DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)下調(diào)，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Taqman低密度表達(dá)芯片為多個(gè)基因的同時(shí)定量表達(dá)提供了一種準(zhǔn)確、快速、有效的多變量檢測(cè)技術(shù)，可用于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因。 2．腫瘤抑制基因LATSl、LATS2、PCDH-