γ-分泌酶抑制劑DAPT對神經干細胞增殖分化影響及可能機制.pdf

1、γ-分泌酶抑制劑DAPT對神經干細胞增殖分化影響及可能機制 目的 采用體外培養(yǎng)的大鼠腦神經干細胞(neuralstemcell，NSCs)，了解γ-分泌酶抑制劑DAPT對神經干細胞分化和增殖能力的影響，檢測Notch通路的信號分子基因表達的情況以及明確與Notch信號調控相關的蛋白質分子及其他與NSCs生物學特性相關的蛋白質，探討DAPT調控神經干細胞增殖和生長的可能機制。 方法 1．采用無血清神經球培養(yǎng)

2、法，從出生2-3d的大鼠腦皮質分離培養(yǎng)NSCs，用免疫熒光細胞染色方法對培養(yǎng)4周的NSCs進行自我更新能力、特異性標志和多向分化能力等方面的鑒定，并將證實為NSCs的細胞用于本研究的實驗。 2．經200nmol／L的DAPT處理后的NSCs，用RT-PCR法檢測Notch通路信號分子(包括RBP-JK，HES1)的表達情況。 3．用CCK-8法和細胞計數(shù)法檢測在200nmoI／LDAPT作用下NSCs的增殖速率。

3、 4．200nmol／L的DAPT處理后的NSCs經l％胎牛血清誘導72h后，用免疫熒光染色結合細胞計數(shù)的方法，觀察其分化為神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞的比例。 5．200nmol／L的DAPT處理后的NSCs經1％胎牛血清誘導72h后，提取細胞總蛋白，用雙向電泳法分離蛋白，并選取與對照組表達顯著差異的蛋白質點進行質譜分析，明確與Notch信號調控相關的蛋白質分子及其他與NSCs生物學特性相關的蛋白質。 結果

4、 1．從新生大鼠腦皮質分離的細胞在本研究的培養(yǎng)系統(tǒng)中呈神經球懸浮生長，抗Nestin和BrdU抗體免疫熒光染色均呈陽性，經誘導可分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。 2．RT-PCR法顯示200nmol／LDAPT作用后，細胞Notch信號分子RBP-JK和HESl的表達均減少，表明200nmol／LDAPT使Notch信號通路受到抑制。 3．CCK-8法檢測和細胞計數(shù)結果均顯示200nmol／LDAPT可抑制N

5、SCs的增殖。 4．200nmol／LDAPT后的NSCs分化發(fā)生變化，與對照組相比，神經元和少突膠質細胞的比例增加，分別由(3．7±1．039)％和(4．8±1．216)％，上升為(13．84±1．221)％和(14．75±1．578)％，而星形膠質細胞的比例由(82．84±3．681)％下降為(63．4l±1．202)％。 5．蛋白質雙向電泳結果表明，分離的蛋白質點主要集中在等電點4～7、相對分子質量20000～l5

6、0000區(qū)域，與對照組相比表達差異11個蛋白中，有2個表達下調，9個上調。經質譜鑒定，這些差異表達的蛋白分別屬于轉錄因子、細胞生長調節(jié)因子、G蛋白偶聯(lián)受體、離子通道蛋白和神經微絲蛋白等。 結論 從新生大鼠腦皮質分離培養(yǎng)出的神經干細胞在200nmol／L的y-secretase抑制劑DAPT處理后，Notch通路受到抑制，下游的信號分子RBP-JK和HESl的表達均減少；NSCs的增殖受到抑制，分化發(fā)生變化，神經元和少突膠