環(huán)氧合酶-2基因沉默對人肝癌細胞的抗增殖作用及其機制研究.pdf

1、目的：環(huán)氧合酶-2(COX-2)是參與催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，在大多數(shù)正常組織低表達或不表達，而在多種因素如各種生長因子、細胞因子、內(nèi)毒素、癌基因產(chǎn)物等作用下大量表達，參與炎癥和惡性組織中前列腺素的合成。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在80％以上的結(jié)直腸癌和部分肺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌、乳腺癌和頭頸癌組織中異常表達。流行病學、遺傳學、藥理學的研究表明，COX-2通過抑制細胞凋亡，促進腫瘤血管生成，增

2、加癌細胞侵襲以及免疫抑制作用等多方面的機制參與了某些腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。 方法：一、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測兩種人HCC細胞株HepG2、Hep3B，兩株人正常肝細胞QSG7701和L02以及皮膚成纖維細胞Fb細胞內(nèi)COX-2mRNA的表達，并考察環(huán)氧合酶抑制劑雙氯芬酸對不同細胞增殖的影響，以探討COX-2的表達和COX-2抑制劑抗HCC細胞增殖的關(guān)系。實驗同時觀察了雙氯芬酸和化療藥5-Fu對HCC細胞COX-

3、2mRNA表達的影響； 二、設(shè)計靶向COX-2基因的RNA干擾序列，構(gòu)建作用于COX-2mRNA的發(fā)卡狀RNA(COX-2shRNA)的表達載體，用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000分別進行HepG2細胞的瞬時轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定表達COX-2shRNA的細胞。運用半定量RT-PCR檢測COX-2mRNA表達水平的變化，篩選有效抑制COX-2基因表達的序列； 三、采用CCK-8法考察COX-2shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

4、HepG2細胞后對細胞增殖和細胞對5-Fu的敏感性的影響，分別以DNA梯形條帶形成實驗、透射電子顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)考察細胞轉(zhuǎn)染后DNA降解情況、凋亡細胞的超微結(jié)構(gòu)特征和細胞凋亡比例以及細胞周期阻滯情況，確定細胞通過何種途徑引起生長抑制； 四、運用RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測COX-2shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后對COX-2及下游信號分子的影響，以探討COX-2在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用機制。 結(jié)果：人HC

5、C細胞HepG2、Hep3B和正常肝細胞系L02均高表達COX-2mRNA，而正常肝細胞QSG7701COX-2mRNA表達水平遠遠弱于前三者。人皮膚成纖維細胞Fb不表達COX-2mRNA。雙氯芬酸10～200μmol/L作用72h后，濃度依賴性抑制HepG2和Hep3B的增殖，在10μmol/L的濃度時即顯現(xiàn)顯著的抗增殖作用(P＜0.01)，其半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為76.41和35.21μmol/L。雙氯芬酸在濃度為25μm

6、ol/L以上時顯著地抑制表達COX-2的人正常肝細胞L02的增殖(P＜0.01)，其IC50值為87.44μmol/L。QSG7701對雙氯芬酸的敏感性遠低于上述三種細胞，在濃度大于50μmol/L時才表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用(P＜0.01)，IC50為170.23μmol/L。雙氯芬酸僅在濃度超過200μmol/L時才對Fb細胞表現(xiàn)出細胞毒性。上述結(jié)果表明，雙氯芬酸對表達COX-2的HepG2、Hep3B和L02細胞有顯著的抗增殖作用

7、，對微弱表達COX-2的QSG7701作用弱的多，而對不表達COX-2的Fb細胞濃度在100μmol/L以下時無抗增殖作用。也就是說，雙氯芬酸特異性抑制表達COX-2細胞的生長。 雙氯芬酸50μmol/L處理HepG2細胞72h后，COX-2mRNA表達量明顯上升，與對照相比上調(diào)了36.80％(P＜0.01)，5-Fu5μg/mL作用72hCOX-2mRNA表達上調(diào)了27.12％(P＜0.05)。雙氯芬酸50μmol/L和5-F

8、u5μg/mL作用Hep3B細胞72h后，分別使COX-2mRNA表達上調(diào)了83.56和79.09％(P＜0.01)。雙氯芬酸上調(diào)HepG2細胞COX-2mRNA的機制有待進一步研究，而5-Fu上調(diào)COX-2mRNA表達的作用可能是HCC對5-Fu敏感性不佳的原因之一。 PCR和質(zhì)粒測序結(jié)果證明已成功構(gòu)建COX-2shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染HepG2細胞并經(jīng)PCR檢測篩選出一有效抑制COX-2基因表達的序列。轉(zhuǎn)染COX-2shRN

9、A表達載體后細胞內(nèi)COX-2mRNA表達水平隨時間延長呈不斷下降的趨勢，24h后下降為錯義序列對照組的74.49±5.45％，48h下降為54.21±5.8％，72h后為42.64±6.42％。為排除細胞轉(zhuǎn)染效率的干擾，對轉(zhuǎn)染COX-2shRNA質(zhì)粒的細胞進行G418篩選。RT-PCR檢測顯示，細胞內(nèi)COX-2mRNA水平下降了75.30％(P＜0.01)，表明經(jīng)篩選所獲得的穩(wěn)定表達COX-2shRNA的細胞COX-2基因沉默效應增強。

10、 采用CCK-8法對HepG2細胞增殖活性進行檢測顯示，轉(zhuǎn)染COX-2shRNA表達載體24、48和72h后細胞增殖活性呈時間依賴性的降低，分別下降為轉(zhuǎn)染錯義質(zhì)粒對照組的87.00±9.97％，82.50±8.88％和80.12±10.66％?？紤]到瞬時轉(zhuǎn)染可能因轉(zhuǎn)染效率干擾抗增殖效應，我們進一步考察穩(wěn)定表達COX-2shRNA的HepG2細胞增殖活性的變化。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達COX-2shRNA的細胞增殖活性較表達錯義序列的細

11、胞下降了29.33％(P＜0.01)，提示COX-2基因沉默可在一定程度上抑制表達COX-2的HepG2細胞的增殖。 利用透射電子顯微鏡對表達COX-2shRNA的HepG2細胞超微結(jié)構(gòu)進行觀察顯示，穩(wěn)定表達COX-2shRNA的細胞中存在自發(fā)性的凋亡現(xiàn)象，視野內(nèi)可見相當數(shù)量的凋亡細胞，主要特征為染色質(zhì)凝聚，電子密度增高，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡以及脂膜包裹的顆粒等現(xiàn)象。提取細胞DNA進行凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48h提取的DNA開始形成明

12、顯的梯形條帶，72h更為明顯，96h后仍然存在。穩(wěn)定表達COX-2shRNA的細胞的DNA電泳同樣可形成明顯的梯形條帶。上述結(jié)果表明COX-2shRNA可誘導細胞凋亡，使細胞核內(nèi)DNA發(fā)生片斷化斷裂從而形成梯形條帶。 流式細胞術(shù)對穩(wěn)定表達COX-2shRNA的HepG2細胞進行凋亡率和細胞周期分析顯示，未轉(zhuǎn)染和表達錯義序列的細胞自發(fā)性凋亡細胞的比例很少，凋亡率僅為4.47±2.80％和4.63±1.55％，而穩(wěn)定表達COX-2s

13、hRNA的細胞出現(xiàn)了較高的凋亡比例，凋亡率為17.83±1.26％。 為探討COX-2基因沉默后下游信號分子的改變，以闡明COX-2基因沉默通過何種方式引發(fā)細胞凋亡，我們采用RT-PCR方法檢測了COX-2shRNA對HepG2細胞內(nèi)抗凋亡蛋白survivin和Bcl-2mRNA的影響。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達COX-2shRNA的HepG2細胞survivin和Bcl-2mRNA下降為錯義組的30.91±4.59％和45.12±11

14、.69％，表明COX-2基因沉默下調(diào)survivin(P＜0.01)和Bcl-2mRNA的水平(P＜0.01)，從而誘發(fā)細胞凋亡。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在腫瘤血管生成和侵襲中起關(guān)鍵作用，實驗發(fā)現(xiàn)HepG2細胞轉(zhuǎn)染COX-2shRNA后，VEGF和MMP-2mRNA分別下降為錯義組的55.85±4.85％和35.30±10.75％，表明COX-2基因沉默可抑制VEGF(P＜0.01)和MMP-2

15、mRNA(P＜0.01)的表達，提示在HCC血管形成和轉(zhuǎn)移侵襲的過程中，COX-2通過上調(diào)VEGF和MMP-2的表達發(fā)揮促進作用。 用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，表達COX-2shRNA的HepG2細胞內(nèi)COX-2蛋白水平下降為表達錯義序列組的31.25±5.17％(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染錯義質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染的組之間無顯著性差異。此結(jié)果進一步從蛋白水平證明COX-2shRNA可有效地抑制COX-2基因的表達。我們同時測定了Bcl-2水平的變

16、化，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達COX-2shRNA的HepG2細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的水平下降為錯義序列組的54.93±6.64％，表明COX-2基因沉默后Bcl-2的表達水平顯著下降(P＜0.01)。 結(jié)論：雙氯芬酸特異性地抑制表達COX-2的HCC細胞的增殖，提示COX-2在HCC細胞的增殖中發(fā)揮作用。利用COX-2shRNA表達載體進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA干擾的方法可有效地在mRNA和蛋白水平抑制肝細胞癌HepG2細胞COX-2基因的表達，

17、并對細胞產(chǎn)生顯著的抗增殖作用。5-Fu增強HCC細胞內(nèi)COX-2mRNA的表達，COX-2基因沉默顯著提高細胞對5-Fu的敏感性，提示COX-2可能與HCC對化療的抵抗有關(guān)。COX-2基因沉默后下調(diào)抗凋亡蛋白survivin和Bcl-2的表達而導致細胞凋亡，并誘發(fā)細胞周期阻滯，從而產(chǎn)生抗HepG2細胞增殖的作用。在血管生成和癌細胞侵襲中起重要作用的VEGF和MMP-2mRNA的水平在COX-2基因沉默后下降則提示COX-2在HCC的血管