大鼠胎肝干-祖細(xì)胞的離心富集和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染——利用Percoll離心技術(shù)富集移植種子細(xì)胞.pdf

1、肝干/祖細(xì)胞移植治療各種終末期肝病，是目前最具吸引力和最有前景的研究熱點(diǎn)。然而，肝再生修復(fù)肝損傷的細(xì)胞系起源，是造血源性還是肝源性肝祖卵圓細(xì)胞仍然備受爭議。目前為止，胎肝細(xì)胞被認(rèn)為是滿足肝細(xì)胞移植條件的唯一細(xì)胞來源，其用于肝再生的優(yōu)點(diǎn)是：(1)移植后不需要選擇壓力來促使胎肝細(xì)胞增殖；(2)細(xì)胞移植后長時間繼續(xù)增殖；(3)同時再造肝細(xì)胞和膽管，形成完整的肝小葉。然而，由于胎肝中細(xì)胞成分復(fù)雜，肝臟干細(xì)胞（liverstemcells,HpS

2、Cs）缺乏確定的標(biāo)志，阻礙了胎肝干/祖細(xì)胞（fetalliverstem/progenitorcells,FLSPCs）的分離。本研究利用Percoll連續(xù)和非連續(xù)密度梯度離心法，進(jìn)行FLSPCs的富集。選取可能的干細(xì)胞標(biāo)志，對富集的胎肝細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞特性的鑒定。體外培養(yǎng)，動態(tài)觀察FLSPCs的生長和分化模式，研究LSCs對于肝臟形成和損傷修復(fù)的作用。進(jìn)一步利用pAcGFP1-N1轉(zhuǎn)染FLSPCs使其能表達(dá)綠色熒光蛋白（greenflu

3、orescenceprotein,GFP）作為示蹤，以搭建研究胎肝肝干細(xì)胞移植效果的可靠平臺。最后以化學(xué)毒劑CCl4制造急性肝損傷模型，初步觀察FLSPCs的修復(fù)效果。搭建FLSPCs移植修復(fù)急性肝損傷的平臺，具有雙重生物學(xué)意義：發(fā)掘肝細(xì)胞移植的可靠種子來源；明確肝損傷時細(xì)胞的遷移機(jī)制。
　　研究目的：
　　1．示蹤FLSPCs的構(gòu)建：利用Percoll離心技術(shù)富集FLSPCs，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP的FLSPCs。

4、r>　　2．FLSPCs的修復(fù)效果：探討經(jīng)門靜脈移植FLSPCs對大鼠CCl4所致急性肝損傷的影響。
　　研究方法：
　　1．FLSPCs的富集和鑒定
　　將胎齡14d的大鼠胎肝酶消化后，利用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法（Percolldiscontinuousgradientscentrifugation,PDGC）進(jìn)行FLSPCs的初次富集。選取7個可能的LSCs標(biāo)志，行流式細(xì)胞儀檢測單陽性細(xì)胞及雙陽性細(xì)胞所

5、占的百分率。利用Percoll連續(xù)密度梯度離心法（Percollcontinuousgradientscentrifugation,PCGC）將培養(yǎng)細(xì)胞分層。由上至下選取1、2層作為二次富集后的FLSPCs，進(jìn)行干細(xì)胞的鑒定。
　　2．?dāng)U增和純化
　　以含有EDTA的0.25％的胰蛋白酶消化5min為限，棄去上層漂浮的細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，以貼壁時間100min為界限，超過該段時間未發(fā)生貼壁的細(xì)胞去除，余下的細(xì)胞繼續(xù)培

6、養(yǎng)。
　　3．FLSPCs的轉(zhuǎn)染示蹤
　　提取pAcGFP1-N1質(zhì)粒，1％瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定質(zhì)和量合格。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pAcGFP1-N1質(zhì)粒導(dǎo)入FLSPCs。利用新霉素梯度篩選法，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的FLSPCs。
　　4．FLSPCs的移植修復(fù)
　　將近交系SD大鼠隨機(jī)分成空白對照組（A）、損傷造模組（B）和FLSPCs移植組（C）。A組腹腔注射生理鹽水，B、C組腹腔注射CCl4。24h后戊巴比妥

7、腹腔麻醉，消毒開腹，B組門靜脈注入生理鹽水，C組門靜脈注入GFP示蹤的FLSPCs懸液。4wk后，采血測定肝功能，取組織標(biāo)本行HE染色觀察病理，并利用熒光顯微鏡追蹤GFP標(biāo)記的細(xì)胞。
　　研究結(jié)果：
　　1．經(jīng)流式檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PDGC初次富集的FLSPCs干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)率均在50％以上，包括常用的標(biāo)志CD133和CD49f，尤其CD117和C-Met表達(dá)率達(dá)到85％以上。40％Percoll溶液作為梯度介質(zhì)，以PCGC能將較

8、好地將細(xì)胞分層。隨著細(xì)胞層次的增加，即細(xì)胞大小的增長，干細(xì)胞表面標(biāo)志逐漸下降（P<0.05）。尤其是第4層，干細(xì)胞表面標(biāo)志驟降，提示成熟細(xì)胞層的出現(xiàn)。經(jīng)過二次富集，F(xiàn)LSPCs的CD133和CD49f表達(dá)率達(dá)到73％以上。
　　2．隨著體外擴(kuò)增，細(xì)胞出現(xiàn)了大小的不均一性。經(jīng)胰酶消化后，較大的細(xì)胞在5min左右回縮被消化，體積較小的細(xì)胞則保持原狀態(tài)。經(jīng)傳代培養(yǎng)時，較小的細(xì)胞在100min時幾乎都貼壁伸展，較大的細(xì)胞難以貼壁，經(jīng)過去除

9、后，細(xì)胞群呈現(xiàn)較好的一致性。
　　3．轉(zhuǎn)染pAcGFP1-N1質(zhì)粒后4h，藍(lán)光激發(fā)下，熒光顯微鏡觀察到個別細(xì)胞發(fā)出綠光的FLSPCs。轉(zhuǎn)染后10d，大量細(xì)胞發(fā)出熒光，細(xì)胞分布欠均勻。轉(zhuǎn)染后20d，大量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，密度分布較一致。30d后，檢測到轉(zhuǎn)染率為60％。在新霉素的挑選下，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸凋亡，最終為熒光細(xì)胞替代。
　　4．A、B、C三組血清ALT、AST水平差異明顯（P<0.01），說明模型制造是成功的，且經(jīng)門靜

10、脈移植FLSPCs能有效緩解CCl4致急性肝功能損傷水平。病理檢測顯示：A組肝臟損傷輕微；B組大量炎細(xì)胞浸潤，大面積肝細(xì)胞壞死，部分肝板結(jié)構(gòu)破壞；C組炎細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞水腫、脂肪變性，肝板結(jié)構(gòu)完整。揭示門靜脈注入FLSPCs能有效改善CCl4所致急性肝病理損傷程度。冰凍切片熒光顯微鏡下可以觀察到由FLSPCs分化而來的肝細(xì)胞形成的肝板結(jié)構(gòu)，提示其參與肝臟的再生與修復(fù)。
　　研究結(jié)論：
　　1．成功建立了一套簡單有效的富集