疏水改性多糖及其葉酸偶合體作為納米藥物載體的研究.pdf

1、本研究對生物相容性良好的天然多糖進(jìn)行了疏水改性，以通過自組裝的方法制備納米粒；再將疏水改性多糖與葉酸偶聯(lián)制備對腫瘤細(xì)胞具有靶向作用的載體材料，為腫瘤靶向制劑載體的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.乙酰普魯蘭及其葉酸偶聯(lián)體作為納米藥物載體的研究通過乙?；磻?yīng)合成了疏水性的乙酰普魯蘭(PA)，然后以N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)為偶聯(lián)劑，4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，將葉酸與PA偶聯(lián)(FPA)；

2、采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)、氫核磁光譜(1H NMR)和X射線晶體衍射(XRD)等方法對產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征；溶解性研究表明PA及FPA不溶于水，但可溶于多種有機(jī)溶劑。采用溶劑擴(kuò)散法制備了PA及FPA納米粒，并考察了各種制備條件對納米粒形成的影響以確定最佳制備方法，結(jié)果表明，納米粒粒徑受到乙?；〈?、材料濃度、水相中PVA濃度、有機(jī)相/水相比值以及有機(jī)溶劑的種類等因素影響。以表阿霉素(epirubicin，EPI)為模型藥物考察了

3、乙?；〈?、藥物/材料比值及脫鹽酸時三乙胺/表阿霉素摩爾比對納米粒載藥的影響；動態(tài)光散射粒徑分析顯示載藥納米粒粒徑隨載藥量增加而增大，透射電鏡觀察納米粒載藥前后均為球形。采用透析法測定納米粒中表阿霉素的體外釋放，藥物釋放速度依次為：FPA>PAl>PA2>PA3；不同pH釋放介質(zhì)藥物釋放速度依次為：pH6.4>pH7.0>pH7.4。 采用激光共聚焦顯微鏡觀察游離EPI、PA/EPI納米粒和FPA/EPI納米粒溫育不同時間KB

4、細(xì)胞攝取的情況，結(jié)果表明，三種表阿霉素制劑在細(xì)胞內(nèi)的分布有一個動態(tài)變化過程，以游離表阿霉素最容易進(jìn)入細(xì)胞核，其次為FPA/EPI納米粒，最后為PA/EPI納米粒。流式細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果表明，各種表阿霉素制劑進(jìn)入細(xì)胞量在4h內(nèi)隨溫育時間的延長而增加，溫育1h細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度依次為：游離EPI>PA/EPI NPs>FPA/EPI NPs>FPA/EPI NPs+FA；溫育4h細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度依次為：FPA/EPI NPs≥EPI>PA/EPI

5、 NPs>FPA/EPI NPs+FA：游離葉酸可明顯減少FPA納米粒進(jìn)入細(xì)胞量，提示FPA納米粒通過葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞。用MTT法測定了空白PA及FPA納米粒對KB及L929細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明兩種空白納米粒均無明顯的毒性；游離表阿霉素、PA/EPI及FPA/EPI納米粒對KB細(xì)胞的毒性隨溫育時間的延長而增加，F(xiàn)PA納米粒表現(xiàn)得尤其明顯；FPA/EPI納米粒在KB細(xì)胞的毒性可被過量游離葉酸抑制，提示FPA納米粒與游離葉酸競爭細(xì)胞膜表

6、面葉酸受體。對L929細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的濃度下納米粒包載表阿霉素的毒性弱于游離表阿霉素。 2.脫氧膽酸修飾殼聚糖及其葉酸偶聯(lián)體作為納米藥物載體的研究脫氧膽酸及葉酸結(jié)構(gòu)中的羧基通過與殼聚糖結(jié)構(gòu)中的氨基偶聯(lián)，生成脫氧膽酸修飾殼聚糖(CS-DA)及其葉酸偶聯(lián)體(FA-CS-DA)。采用FT-IR、1H NMR、XRD等方法對該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，結(jié)果表明葉酸通過化學(xué)鍵偶聯(lián)于CS-DA。CS-DA1～3中脫氧膽酸的取代度用

7、元素分析法進(jìn)行測定分別為9.6、7.7及2.8；FA-CS-DA1，2中葉酸的取代度用紫外法分析分別為170μmol/g聚合物及186μmol/g聚合物。采用透析-超聲法制備了CS-DA及FA-CS-DA自組裝納米粒，熒光探針法研究其自組裝行為，結(jié)果顯示，CS-DA的臨界膠束濃度(CMC)因脫氧膽酸取代度不同而在0.015mg/ml～0.046mg/ml內(nèi)變化，F(xiàn)A-CS-DA1和FA-CS-DA2的CMC分別為0.028mg/ml和0

8、.049mg/ml；CS-DA納米粒粒徑為115.7nm～196.5nm，F(xiàn)A-CS-DA粒徑為200nm～350nm。用超聲法將全反式維甲酸(ATRA)包裹于CS-DA和FA-CS-DA納米粒中，其包載率達(dá)12％，粒徑隨ATRA載藥量增加而增加。 用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的納米粒進(jìn)行了納米粒的體外攝取研究(KB細(xì)胞)，并采用熒光分光光度法測定了納米粒的攝取量，結(jié)果顯示，在0.5～2h內(nèi)納米粒攝取量隨溫育時間增加而增加，細(xì)胞對相同

9、濃度FA-CS-DA納米粒攝取量高于CS-DA納米粒，且KB細(xì)胞對FA-CS-DA納米粒的攝取可被過量游離葉酸所抑制，提示葉酸受體參與了FA-CS-DA與KB細(xì)胞的結(jié)合和/或攝取。 總之，疏水改性多糖及其葉酸偶聯(lián)體可通過自組裝的方法制備納米粒，制備方法簡單可行，該納米?？勺鳛樗幬镙d體包載雙親性或疏水性藥物，從而延緩藥物的釋放和增加藥物的穩(wěn)定性。葉酸偶聯(lián)多糖納米粒在葉酸高表達(dá)KB細(xì)胞主要通過葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)一定