胃癌轉移相關轉錄因子篩選及SRF調控miR-199a促進胃癌轉移的分子機制研究.pdf

1、胃癌轉移是多基因參與，受多種信號轉導蛋白和轉錄因子調控的一個復雜的過程，而轉錄因子的調控作用是轉移過程中的關鍵問題，可能為胃癌轉移研究提供新的預測指標和干預靶點。目前關于胃癌相關的轉錄因子主要包括AP-1,NF-κB,Sp1,EGR,CREB,ATFs等，這些轉錄因子并不能完全解釋胃癌轉移的分子機制，新的轉錄因子的發(fā)現及其具體調控通路的分子機制研究迫在眉睫。
　　既往的研究表明，SRF可能是一個潛在的促腫瘤轉移分子，它可以在體外促

2、進結腸癌、肺癌及乳腺癌細胞系發(fā)生轉移；而其具體機制、通過哪些分子、通路發(fā)揮作用還不清楚。同時，SRF在胃癌轉移中發(fā)揮什么作用、及其具體作用機制有待于進一步深入探討。本課題將對以上這些問題進行研究。
　　【目的】
　　1、通過體內篩選探討參與胃癌轉移相關的轉錄因子；
　　2、探討篩選出的轉錄因子SRF與胃癌發(fā)生侵襲、轉移及粘附等的相關性；
　　3、找出SRF下游效應miRNA分子，探討SRF促進胃癌細胞轉移的可能機

3、制的影響。
　　【方法】
　　1、采用轉錄因子活性譜芯片方法通過兩次比較高、低轉移潛能的胃癌轉移細胞系得到與胃癌轉移相關的轉錄因子并驗證；
　　2、采用Westernblot、免疫組織細胞化學觀察活性的SRF蛋白在胃癌有轉移組織中的表達和細胞定位；
　　3、通過基因重組方法構建SRF的siRNA質粒、全長上調質粒(饋贈)和對照質粒；
　　4、采用體外細胞粘附實驗、侵襲、遷移實驗、體內裸鼠尾靜脈注射肝臟轉移實

4、驗等研究SRF對胃癌細胞GC9811、GC9811-P和SGC7901的粘附、侵襲、遷移和體內轉移能力的影響；
　　5、通過realtimePCR檢測胃癌轉移組織及細胞系中轉染SRFsiRNA質粒后的SRF、miR-199a-5p、miR-199a-3p表達水平變化；
　　6、采用染色質CHIP、啟動子報告基因、雙熒光素酶報告基因實驗檢測SRF與miR-199a基因是否存在直接的正向或者負向調控關系。同時通過體外實驗驗證mi

5、R-199a對腫瘤的轉移能力的影響。
　　【結果】
　　1、通過體內轉移模型篩選胃癌轉移相關轉錄因子
　　我們采用高通量轉錄因子活性譜芯片，通過對體內篩選得到的低轉移胃癌細胞系GC9811和高轉移胃癌細胞系GC9811-P兩種細胞系進行兩次篩選，得到了20個可能與胃癌轉移相關的轉錄因子。其中包括目前已報道與腫瘤轉移密切相關的轉錄因子NF-κB，AP-1，ATFs，Sp1，CREB，EGR。經過ELISA驗證，我們選擇其

6、中SRF為研究對象進行進一步探討。
　　2、有活性的轉錄因子SRF在轉移胃癌組織及細胞中表達升高
　　我們采用免疫組化技術檢測了活化的SRF蛋白在25例胃的正常組織、25例沒有腸化生的炎癥組織、21例慢性胃炎伴腸化生組織、28例胃癌原發(fā)灶和26胃癌淋巴結轉移灶、22例遠端轉移組織中的表達，結果發(fā)現與原發(fā)灶等組織相比，活化的SRF（p-SRF）主要定位于胃癌轉移組織細胞的胞漿和胞核中，以胞核為主。采用WesternBlot方法

7、檢查6例胃癌的癌旁組織、原發(fā)灶和轉移灶的胞漿蛋白和胞核蛋白表達，結果與免疫組化相同。同樣，SRF在低轉移胃癌細胞GC9811中主要為胞漿表達，而在高轉移胃癌細胞GC9811-P細胞中主要為胞核表達。以上結果提示：SRF在胃癌組織細胞發(fā)生轉移早期主要在胞漿中表達，經過磷酸化后活化的SRF從胞漿中轉位進入細胞核，進而促進胃癌發(fā)生轉移。
　　3、體內、外實驗證實轉錄因子SRF可以促進胃癌細胞侵襲、轉移。
　　我們進而構建了SRF的

8、siRNA載體，同時也購買了SantaCruz的siRNA載體，穩(wěn)定轉染或者瞬時轉染了胃癌高轉移細胞系GC9811-P細胞和胃癌SGC7901細胞。結果發(fā)現SRFsiRNA轉染后，GC9811-P細胞和SGC7901對細胞外基質Matrigel的粘附能力下降。敲除SRF也抑制了GC9811-P細胞和SGC7901細胞穿過帶Matrigel膠或者沒有鋪膠的Millicell小室遷移能力及劃痕實驗中兩細胞的遷移能力，進而證明SRF可以影響胃

9、癌細胞的侵襲、遷移能力。體內裸鼠尾靜脈注射遷移實驗表明，SRFsiRNA能明顯抑制GC9811-P及SGC7901細胞的肝臟、肺臟及腹膜轉移能力。采用SRF全長質粒上調胃癌低轉移細胞系GC9811及SGC7901細胞系后，兩細胞系的侵襲、遷移、粘附能力顯著增強。上述結果提示，胃癌細胞中的SRF是影響胃癌細胞侵襲、遷移、粘附和體內轉移能力的重要分子。
　　4、轉錄因子SRF通過調控miR-199a分子的表達促胃癌細胞侵襲、轉移。

10、r>　　先前有研究提示SRF在心肌細胞中可通過影響含有CArG元件的miRNAs分子的表達來發(fā)揮其調控作用。我們進一步用realtimePCR方法證實SRF能上調miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達。同時實驗中也發(fā)現，與對照組織相比，在SRF高表達的胃癌轉移組織及細胞中，miR-199a-3p和miR-199a-5p也為高表達。SRFsiRNA轉染敲除SRF的表達后，GC9811-P細胞中的miR-199a-3p和miR

11、-199a-5p表達顯著下調。同時發(fā)現在胃癌高轉移GC9811-P細胞中的SRF在細胞核內可以直接結合miR-199a-1和miR-199a-2的啟動子區(qū)域，進而正向啟動miR-199a-1和miR-199a-2的轉錄，其成熟的miRNAs分子中miR-199a-5p可以促進胃癌轉移，而miR-199a-3p沒有顯著作用。
　　【結論】
　　本研究經過胃癌體內轉移模型篩選出與胃癌轉移相關的轉錄因子，并發(fā)現其中有活性的轉錄因子