乙醇對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響及其分子機制研究.pdf

1、妊娠期間攝入乙醇對胚胎發(fā)育有嚴重影響，胎兒酒精綜合征(FetalAlcoholSyndrome，F(xiàn)AS)是最主要的發(fā)育畸形，表現(xiàn)為頭面部畸形、心血管系統(tǒng)發(fā)育障礙和永久性神經系統(tǒng)損傷。許多模式生物用于研究乙醇對胚胎發(fā)育的影響，但是不同的模式生物各有優(yōu)缺點。斑馬魚作為模式生物，其發(fā)育過程與人類有很高的同源性，并具有發(fā)育周期快、胚體透明等優(yōu)點，已廣泛應用于發(fā)育遺傳學和環(huán)境毒理學的研究。Laale等首先發(fā)現(xiàn)乙醇能引起斑馬魚獨眼畸形。除此之外，乙

2、醇的致畸作用所表現(xiàn)出的表型十分復雜，主要還包括心前區(qū)水腫、循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育障礙、體軸發(fā)育回形、雙側肝臟、前腦發(fā)育畸形等表型，但其具體分子機制仍然不明。 1.乙醇干擾斑馬魚心血管系統(tǒng)的發(fā)育 先天性心臟病和心血管發(fā)育畸形在FAS患兒中發(fā)生率接近50％，主要表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、肺動脈發(fā)育不全、主動脈狹窄。但是由于這些改變大多需要心導管檢查才能診斷，發(fā)現(xiàn)比較困難，因此長期以來未受到人們重視。我們在斑馬魚FAS模型中，觀察到

3、乙醇對斑馬魚心血管系統(tǒng)的發(fā)育有很強的干擾作用。實驗中，用不同濃度的乙醇處理斑馬魚胚胎，發(fā)現(xiàn)能夠干擾其胚胎循環(huán)系統(tǒng)的建立，半數(shù)有效濃度(EC50)為182．5mM。乙醇短暫暴露實驗顯示圓頂期為敏感時間窗，400mM乙醇短暫暴露3h能夠導致43％的胚胎產生循環(huán)障礙。我們排除了乙醇對斑馬魚造血系統(tǒng)影響，通過血管內皮細胞分子標記(Flk-1)進行原位雜交顯示，乙醇干擾了軀干部體軸血管的建立，而對頭面部血管沒有影響。用動脈和靜脈的分子標記(eph

4、rinB2和ephB4)進行原位雜交以及半薄切片顯示，乙醇主要干擾斑馬魚背主動脈的形成，而對體軸靜脈沒有明顯影響。進一步研究表明，乙醇影響斑馬魚底索的發(fā)育，因缺少底索分泌的Radar和Ang-1等血管形成因子，間接地影響了背主動脈的形成和穩(wěn)定。這些結果為研究乙醇對人類心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響提供了線索。 2．斑馬魚早期胚胎蛋白質組學分析 采用二維凝膠電泳分離斑馬魚受精卵期、圓頂期、胚盾期和5體節(jié)期的胚胎總蛋白。銀染后，通過凝

5、膠掃描儀獲取凝膠圖像，并用ImageMaster2D軟件分析。檢測出受精卵期間蛋白點226個，圓頂期蛋白點307個，胚盾期蛋白點327個，5體節(jié)期蛋白點574個。顯示受精卵期至胚盾期蛋白數(shù)量有少量增加，至5體節(jié)期蛋白數(shù)量急劇增加，表明蛋白表達數(shù)量與形態(tài)學的變化和器官發(fā)生有密切關系。48％的早期蛋白點在5體節(jié)期蛋白圖譜中仍然存在，提示母體蛋白質對斑馬魚胚胎的發(fā)育起著重要的作用。選取4個不同發(fā)育階段共有的3個高豐度蛋白點進行質譜鑒定，結果為

6、卵黃蛋白的三種不同剪切形式，表明斑馬魚早期胚胎樣品中卵黃生成素豐度較高。本文對斑馬魚胚胎蛋白質組學的相關技術進行了改進，建立了斑馬魚早期胚胎發(fā)育的二維電泳圖譜，為進一步開展斑馬魚功能蛋白質組學的研究提供重要平臺。 進一步莉用二維電泳分離正常對照組及乙醇處理組胚胎總蛋白。ImageMaster2DE1ire軟件對正常和乙醇處理胚胎二維電泳進行差異分析，發(fā)現(xiàn)表達下調的蛋白點3個，表達上調的蛋白點7個。質譜鑒定結果表明這三個下調蛋白點

7、分別為前腦菲肽原、TARDNA結合蛋白和膠原蛋白2a1。這為進一步研究乙醇致畸作用的分子機制提供重要線索。 3．乙醇干擾斑馬魚Nodal信號通路 我們證明了乙醇導致的體軸發(fā)育障礙是由于乙醇干擾了軸中胚層的發(fā)育，而獨眼畸形是由于乙醇干擾了前脊索板(prechordalplate)遷移引起的。通過原位雜交證實了二維電泳的結果，發(fā)現(xiàn)乙醇干擾了軸中胚層的細胞外基質——Co12a1的表達。我們還發(fā)現(xiàn)乙醇能夠影響斑馬魚胚胎左右軸分化

8、，并且認為這種改變是由于乙醇干擾了Nodal信號通路導致的。為了證明這一假設，將外源性Noda1信號分子注射入斑馬魚胚胎，誘導其下游基因gsc和nt1的表達。通過檢測乙醇暴露后gsc和nt1的表達水平變化，證明了乙醇作用于Nodal信號通路干擾斑馬魚胚胎的發(fā)育。文獻報道，乙醇處理胚胎能夠使其．shh基因表達下調，但究竟乙醇是否直接干擾shh信號通路目前還沒有定論。我們將外源性的shh信號分子注射入斑馬魚胚胎，誘導其下游基因foxA2和n

9、kx2．2a的表達。通過檢測乙醇暴露后foxA2和nkx2．2a的表達水平變化，證明了乙醇對shh信號通路沒有直接的干擾作用。 Nodal的長程效應對維持胚胎內Nodal濃度梯度起著重要的作用，sqt主要參與Nodal長程旁分泌，而crc則參與Nodal短程旁分泌。我們發(fā)現(xiàn)乙醇對不同Nodal信號分子的干擾作用是不同的，將sqt和cycmRNA注射入128細胞期胚胎動物極的單個細胞內，然后用乙醇處理，結果表明乙醇主要干擾了sqt