骨髓基質干細胞與生物衍生骨復合修復山羊脛骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 研究骨髓基質干細胞(marrowstromalcells，MSCs)與生物衍生骨復合構建組織工程骨，修復山羊脛骨的大段骨-骨膜缺損，以探討其修復大段負重骨缺損的可行性；比較骨髓基質干細胞與生物衍生骨分別在體內、體外復合所構建的組織工程骨修復山羊脛骨的大段骨-骨膜缺損的能力，以探討修復大段負重骨缺損最佳途徑，比較體外構建與體內構建的組織工程骨修復山羊脛骨大段骨-骨膜缺損的血管化進程以及血管化與成骨的關系，了解不同組織工程骨修復長管狀

2、負重骨缺損的血管化情況，為進一步組織工程骨的臨床實驗提供依據。 方法1.取健康成人尸體脛骨，徹底清除軟組織，切除干骺端松質骨及皮質骨，制成3.0×1.0×1.0cm3的柱狀骨塊，每骨塊均同時包含部分松質骨及皮質骨，經脫細胞、脫脂、脫蛋白、去抗原處理后凍干制成生物衍生骨，分裝密封，用環(huán)氧乙烷消毒滅菌備用。 2.取健康山羊在無菌條件下穿刺抽取紅骨髓，梯度離心、分離；接種于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2和飽

3、和濕度條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)的細胞相互匯合達到90％生長面積時用0.25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。待細胞傳至3代時，培養(yǎng)基內加入地塞米松、維生素、β-甘油磷酸納誘導3天后標記、消化、計數(shù)備用。 3.將生物衍生骨用DMEM培養(yǎng)基浸泡1天后棄殘液，每個支架材料上按106/ml的密度接種經誘導細胞，在37℃、5％CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，從而體外構建成組織工程骨。 4.將實驗用12月齡健康雜種青山羊麻醉后，取仰臥位，沿脛前外側作弧

4、行切口，分離脛骨，不剝離骨膜。在距脛骨結節(jié)49mm-71mm處，用線鋸鋸斷脛骨及骨膜。用8孔動力加壓鋼板螺絲釘固定，造成至少20mm的骨-骨膜缺損模型。 5.用體外構建成的組織工程骨或單純生物衍生骨修復骨缺損，分別作為實驗組和對照組，空白組則直接逐層關閉切口。于術后2、4、6、8、12、16、24周取出骨缺損修復標本，分別作大體觀察、組織學觀察、BrdU特異性染色、掃描電鏡觀察、X線檢查、骨密度測定結果、生物力學檢測，了解組織工

5、程骨的生物相容性及比較各組的成骨能力。 6.用體內構建成的組織工程骨修復骨缺損：將生物衍生骨咬成小碎塊狀，用羊膜將其包裹于鋼板和缺損區(qū)之間，兩端用絲線捆扎，注入1×106/mlMSCs懸液，作為體內構建組；用體外構建成的組織工程骨、自體骨和生物衍生骨修復骨缺損，作為體外構建組、自體骨組和單純材料組。于術后2、4、6、12、16周取出骨缺損修復標本，分別作大體觀察、組織學觀察、BrdU特異性染色、X線檢查、骨密度測定結果、生物力學

6、檢測，了解組織工程骨的生物相容性及比較各組的成骨能力。 7.分別用體內、外構建的組織工程骨修復骨缺損，在2、4、6、12周時間點分別用墨汁灌注后制作透明標本，行組織學觀察和血管面積圖像分析，了解組織工程骨血管化過程及分析其與成骨的相互關系。 結果1.組織學結果顯示體外構建的組織工程骨中早期材料孔隙內無明顯炎性反應，4周時，實驗組中支架材料已開始降解，未發(fā)現(xiàn)明顯的新骨形成，6周有新骨形成，8周支架材料完全降解，為編織骨所代

7、替，16周缺損區(qū)骨組織呈板層狀，有大量典型骨小梁形成，缺損區(qū)骨皮質連續(xù)；24周缺損區(qū)為成熟板層骨，有髓腔形成，尚不典型，內有成熟、含脂肪的黃骨髓；X片顯示8周實驗組骨痂形成明顯，12周有新骨形成，缺損區(qū)骨皮質與骨端皮質相連續(xù)，16周骨皮質達到正常厚度，塑形好，髓腔部分再通，24周肉眼難以分辨缺損區(qū)，骨塑形好；骨密度結果顯示實驗組8周時的骨密度(0.962±0.076)已較對照組(6.240±0.455)高(P＜0.05)；同樣，實驗組8

8、周時的生物力學強度(2.27±0.61)已較對照組(1.02±0.15)高(P＜0.05)。而不論組織學觀察還是X線檢查，24周時空白組骨缺損未修復，為典型的骨不愈合的表現(xiàn)。 2.組織學結果顯示體內、體外構建組早期材料孔隙內無明顯炎性反應，材料降解較快，成骨迅速，體內構建組6周時羊膜已開始降解，12周已完全降解，16周時缺損區(qū)骨組織呈板層狀，有不典型骨小梁形成；X片見體外構建組新骨形成較快，缺損區(qū)密度高，16周時已可見部分髓腔再

9、通，體內構建組以上各變化較前者慢大約2-4周，16周時植入物與骨斷皮質相連續(xù)，但髓腔無再通；生物力學測試彎曲應力在6周時，各組差異無顯著性意義(P＞0.05)，16周時體外構建組(7.27±0.58)高于體內構建組(6.27±0.35)(P＜0.05)，體內構建組高于單純支架材料組(3.65±0.83)(P＜0.05)，體外構建組與自體骨組(7.87±0.89)的彎曲應力差異無顯著性意義(P＞0.05)。 3.體外構建組與體內構

10、建組血管化進程無明顯區(qū)別，術后2周，兩組均可見少量新生血管自移植物邊緣向材料內長入，但血管數(shù)量少，走行紊亂，6周時可見血管形成明顯增多，血管排列紊亂，大量新生軟骨細胞增生，12周新生血管逐漸趨向于有序排列，材料被完全吸收，為新生骨組織所代替；各時間點血管面積差異無顯著性意義(P＞0.05)，12周均能達到完全血管化。 結論1.20mm脛骨缺損對于山羊是不能自行愈合的，符合骨缺損的要求，反映了骨缺損的一般特征。 2.同種異