CD147胞外區(qū)的原核表達(dá)、復(fù)性及其溶液結(jié)構(gòu)的初步研究.pdf

1、HAb18G／CD147屬于免疫球蛋白超家族的成員，是一種在機(jī)體中廣泛表達(dá)的單次跨膜的糖蛋白，參與生命活動(dòng)中的許多生理過程，如腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，淋巴細(xì)胞的遷移和活化，組織修復(fù)與重建，炎癥，Alzheimer’s病等，并且發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。而許多功能的發(fā)揮都依賴于它的胞外段(HAb18GEP)及其糖基化修飾。因此，對HAb18GEP進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)方面的研究，從而闡明它與其它分子的相互作用機(jī)制，對了解它是如何發(fā)揮功能是十分必要的。<

2、br>　　核磁共振技術(shù)最主要的優(yōu)勢在于可以在原子分辨水平上給出溶液中生物大分子的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象信息，尤其能夠簡便快捷地研究蛋白質(zhì)間相互作用，從而獲得生物大分子在有機(jī)體內(nèi)的實(shí)際情況。因此，我們采用NMR方法對HAb18GEP結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究。由于HAb18GEP蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)主要是以包涵體形式存在的，本研究摸索了一套針對HAb18GEP的有效的體外復(fù)性方法，并成功地對其進(jìn)行了復(fù)性。利用核磁共振技術(shù)對HAb18GEP及其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了

3、結(jié)構(gòu)方面的初步研究，完成了C80的主鏈指認(rèn)，為下一步進(jìn)行溶液結(jié)構(gòu)的研究和蛋白質(zhì)相互作用的研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　本研究主要分為三個(gè)部分：
　?。ㄒ唬〩Ab18GEP在大腸桿菌中的表達(dá)、復(fù)性及穩(wěn)定性研究
　　優(yōu)化培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了HAb18GEP的高效表達(dá)，獲得大量以包涵體形式存在的蛋白，并成功對蛋白進(jìn)行了體外復(fù)性。應(yīng)用NMR技術(shù)證明蛋白質(zhì)得到了很好的折疊。對蛋白質(zhì)進(jìn)行了穩(wěn)定方面的研究，確認(rèn)了蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物為9.5kD

4、a的肽段，并且對蛋白樣品的溶液條件進(jìn)行了優(yōu)化，改善了核磁共振實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
　?。ǘ〩Ab18GEP的C－結(jié)構(gòu)域和N－結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、復(fù)性
　　根據(jù)HAb18GEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及對其的穩(wěn)定性研究，分別對HAb18GEP的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆、表達(dá)。對其中的N90和C80蛋白進(jìn)行了表達(dá)、體外復(fù)性、純化，NMR實(shí)驗(yàn)證明得到了很好的折疊。
　?。ㄈ〤80蛋白的主鏈指認(rèn)
　　對C80蛋白進(jìn)行了同位素標(biāo)記、表達(dá)、體外