NLS-RARα相互作用蛋白的篩選與驗證.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構建維甲酸受體變異蛋白(NLS-RARα)的誘餌表達載體，為應用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NLS-RARα相互作用的蛋白建立實驗基礎；利用酵母雙雜交技術篩選與NLS-RARα相互作用的蛋白質，為研究NLS-RARα的作用靶點及其生物學功能奠定基礎。 方法：PCR擴增NLS-RARα，克隆入誘餌載體pGBKT7中，將構建好的誘餌載體pGBKT7-NLS-RARα轉化到酵母細胞AH109中，并利用蛋白印跡法分析誘餌蛋白的表達情況。同

2、時檢測誘餌蛋白有無毒性，滲漏和自激活作用；構建能在哺乳動物細胞表達的載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，經酶切鑒定正確后，共轉染入HEK293細胞，利用免疫共沉淀技術驗證它們之間的相互作用。 結果：成功擴增了NLS-RARα基因片斷，并克隆入pGBKT7中，測序結果正確。誘餌載體成功轉化到酵母細胞AH109中，誘餌蛋白無毒性，無自激活和滲漏，Western Blotting分析證實酵母細胞表達誘餌蛋

3、白；構建的重組表達載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl經酶切鑒定成功，轉染HEK293細胞后，用抗HA多克隆抗體沉淀后，用抗Myc單克隆抗體檢測，能檢測到JTVl的表達。 結論：成功構建了NLS-RARα結合域的酵母誘餌表達載體，為進一步篩選與之相互作用的蛋白奠定了基礎；成功構建了pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，在HEK293細胞表達后利用免疫共沉淀驗證實了NLS-RAR

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