慢病毒介導BMPs基因促進MC3T3-E1細胞成骨作用的實驗研究.pdf

1、背景和目的:
　　 骨再生是治療骨骼系統相關疾病的關鍵環(huán)節(jié)，而大塊骨缺損的修復是骨科醫(yī)生最常遇見的臨床問題。組織工程骨有望解決植骨后新骨形成緩慢的問題，近年來，組織工程技術的發(fā)展日趨成熟，使得骨缺損的修復成為可能，其中如何促進種子細胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術的關鍵環(huán)節(jié)和研究熱點。理想的組織工程化骨必須具備以下三個要素:種子細胞、細胞因子和支架材料。在促進骨形成的眾多調節(jié)因子中，骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎發(fā)育及骨骼形

2、成中扮演重要的角色。目前發(fā)現的BMP家族成員骨誘導活性中研究較多的有BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9等。目的:針對小鼠BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9基因設計、構建第三代自體失活BMPs慢病毒表達載體，并轉染MC3T3-E1細胞，構建成骨誘導因子基因修飾的小鼠類間充質干細胞，觀察感染后細胞各基因和蛋白的干擾效率;觀察感染后細胞體外成骨分化的影響;評價各成骨誘導因子的成骨分化能力。

3、>　　 方法:
　　 以cDNA文庫為模版，應用PCR方法獲得BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，基因的編碼序列，經大腸桿菌轉化后抽取質粒，構建基因表達質粒載體，酶切鑒定重組體并且經測序進一步確定。然后用pLP/VSVG，pLP2，pLP1質粒與BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9共轉染293FT細胞。包裝pELNS-BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9后轉染小鼠間充質干細胞MC3T3-E

4、1細胞，GFP熒光證實轉染效果。茜素紅染色檢測鈣結節(jié)，Western-Blot和Real time PCR檢測成骨相關基因的表達(Runx2)的表達水平，鑒定各成骨誘導因子的單獨轉染效能。最后用雙基因聯合轉染（共7組）MC3T3-E1細胞，GFP熒光證實轉染效果;應用ELISA檢測MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中BGP和ALP的表達水平;應用Real time PCR檢測Runx2 mRNA的表達水平;應用Western blot檢測BM

5、P2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9蛋白的表達水平，鑒定雙基因聯合轉染的成骨分化效能。
　　 結果:
　　 pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9表達質粒構建成功。重組慢病毒pELNS-BMP2，pELNS-BMP4，pELNS-BMP6，pELNS-BMP7，pELNS-BMP9構建成功，成功轉染MC3T3-E1細胞;Runx2表達水

6、平:BMP2＞BMP4＞BMP9＞BMP7＞BMP6;茜素紅染色顯示BMP-2鈣結節(jié)數量最多。雙基因（共8組）聯合轉染MC3T3-E1細胞，GFP熒光證實轉染成功;Runx2 mRNA表達水平:T5＞T3＞T1＞T2＞T6＞T4＞T7;BGP表達:T5＞T3＞T4＞T6＞T2＞T1＞T7;ALP表達:T5＞T3＞T1＞T2＞T4＞T6＞T7;結果顯示，T5(BMP2，BMP7)共轉染成骨效率最高，Western blot證實BMP2和B