Wt1及Wnt-β-catenin通路調(diào)控足細胞發(fā)育及損傷修復研究.pdf

1、目的:
　　探討轉錄因子Wt1及Wnt/β-catenin信號通路在腎小球足細胞發(fā)生發(fā)育及損傷修復中的作用及其分子機制。
　　材料與方法:
　　1.顯微分離胚齡E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d、E18.5 d胎鼠腎臟和出生后P1 d、P7 d、P14 d及P28 d小鼠腎臟。采用基因芯片技術篩選 Wnt/β-catenin信號通路在足細胞發(fā)育過程中的差異表達基因；通過免疫組

2、織化學技術觀察小鼠足細胞發(fā)育不同時間點Wnt/β-catenin通路關鍵分子活化的β-catenin蛋白表達的定位與定量；應用實時定量 RT-PCR技術對小鼠足細胞中 Wt1 mRNA及β-catenin mRNA表達水平進行半定量分析；采用Western blotting技術觀察足細胞發(fā)育過程中活化的β-c atenin蛋白的表達水平變化。
　　2.在33℃條件下通過RPMI1640培養(yǎng)液誘導條件永生化小鼠足細胞系增殖，在37℃

3、條件下誘導小鼠足細胞逐漸分化成熟；設計并合成靶向Wt1的小分子干擾RNA(Small Interfering RNA，siRNA)，待足細胞分化成熟后利用JetPRIMETM進行siRNA轉染；分別應用實時定量RT-PCR技術與Western blotting技術檢測轉染組Wt1 mRNA及蛋白表達水平的變化從而判斷 Wt1沉默效率；采用上述分子生物學技術進一步觀察小鼠足細胞 Wnt/β-catenin通路相關分子和足細胞nephrin

4、表達水平變化；通過MTT技術進一步檢測沉默Wt1的表達后足細胞活力變化情況。
　　結果:
　　1.基因芯片結果表明，Wnt4、Wnt6及DKK1等在小鼠足細胞發(fā)育不同時間點存在表達差異。這些差異表達基因功能分屬于信號轉導過程、基因轉錄與翻譯、酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性等。實時定量RT-PCR結果顯示，Wt1 mRNA的表達在E13.5 d至E15.5 d時，其表達水平逐漸增加，在出生后1天（P1 d）其表達水平明顯增加，隨后直至

5、足細胞發(fā)育成熟其表達量逐漸減少；β-catenin mRNA的表達在E13.5 d至E15.5 d時亦逐漸增加，其在E16.5 d時的表達水平開始下降，隨后其表達水平直至足細胞發(fā)育成熟后均無明顯變化；Wes tern b lo tting結果表明，活化的β-catenin蛋白的表達水平在E14.5 d時達到高峰，隨后逐漸下降，在P1 d時再次出現(xiàn)小高峰，隨后其表達量逐漸下降并維持在低水平。免疫熒光結果顯示，活化的β-c atenin在足

6、細胞發(fā)育的起始階段表達量較高，隨著足細胞發(fā)育成熟，其表達逐漸減少，在發(fā)育成熟的足細胞中，其不表達或表達量較少。
　　2.實時定量RT-PCR和Western blotting結果分析發(fā)現(xiàn)，特異性沉默足細胞Wt1的表達可誘導Wnt1 mRNA和Wnt1蛋白表達水平明顯上調(diào)（P<0.05），β-catenin mRNA及蛋白表達水平未見明顯變化，但β-catenin的磷酸化水平明顯減少（P<0.05）。MTT結果表明 Wt1表達下調(diào)會

7、導致足細胞活力受損，可能與nephrin的表達減少（P<0.05）有關。
　　結論:
　　1.轉錄因子Wt1及Wnt/β-catenin通路的表達在小鼠足細胞發(fā)生發(fā)育過程中的存在時間與空間表達差異，這種特異性的時空表達對于腎臟尤其是足細胞的正常發(fā)育是至關重要的。在足細胞發(fā)育早期，Wnt/β-catenin通路參與啟動足細胞發(fā)育過程，隨著足細胞逐漸發(fā)育成熟，其表達逐漸減少并處于靜止狀態(tài)。
　　2.體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，siR

8、NA技術特異性沉默足細胞Wt1基因的表達可減少足細胞內(nèi)β-c aten in的磷酸化水平，從而使β-catenin的降解減少。提示W(wǎng)t1的表達下調(diào)可誘導Wnt/β-catenin通路的異常激活。此外，本研究尚發(fā)現(xiàn)足細胞 Wt1表達下調(diào)可伴有足細胞活力受損，可能與Wnt/β-catenin通路激活后誘導足細胞裂孔隔膜分子nephrin的表達下調(diào)有關。
　　3.我們通過體外實驗發(fā)現(xiàn) Wt1可能對Wnt/β-catenin信號通路具有負