T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)大鼠胰腎聯(lián)合移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、器官移植對(duì)許多終末期疾病的治療是十分重要的手段，但器官移植導(dǎo)致的排斥反應(yīng)是影響其成功率的主要原因。為了降低排斥反應(yīng)的發(fā)生率，提高器官移植的成功率，目前需要病人終生使用免疫抑制劑。然而，長(zhǎng)期使用免疫抑制劑除了會(huì)引起免疫抑制劑本身的毒副作用（諸如升高血壓、肝腎毒性等不良反應(yīng)）外，也可引起嚴(yán)重感染、惡性腫瘤的發(fā)生，從而影響器官移植的成功率和受者的長(zhǎng)期存活率。若能造成移植宿主對(duì)移植抗原的免疫耐受狀態(tài)或低免疫應(yīng)答狀態(tài)，同時(shí)保持對(duì)其它抗原免疫應(yīng)答的

2、反應(yīng)能力是器官移植領(lǐng)域人們追求的理想目標(biāo)。 同種器官移植后，產(chǎn)生抗同種移植物的排斥反應(yīng)，主要是因?yàn)槭荏w免疫系統(tǒng)識(shí)別供體不相容的MHC 抗原，引起免疫應(yīng)答，觸發(fā)了同種排斥反應(yīng)的結(jié)果。其中同種反應(yīng)性T 細(xì)胞在排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，將其滅活后作為T 細(xì)胞疫苗免疫，可誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受或免疫低反應(yīng)性。T 細(xì)胞疫苗（T Cell Vaccine，TCV）是指用化學(xué)或物理方法滅活的致病性T 細(xì)胞。 其失去致病能力，但保持

3、了活化致病性T 細(xì)胞的免疫特征。研究證明，把引起自身免疫性疾病的自身反應(yīng)性T 細(xì)胞或?qū)е峦N移植排斥反應(yīng)的同種反應(yīng)性T 細(xì)胞制備成TCV，免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)致病性T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答?？梢韵驕p輕這些細(xì)胞的致病作用或反應(yīng)能力，表現(xiàn)為對(duì)自身免疫性疾病的防治作用和誘導(dǎo)同種移植物質(zhì)延長(zhǎng)存活。 糖尿病腎病是糖尿病中危害最嚴(yán)重、致死率最高的一種并發(fā)癥，我國(guó)糖尿病病人中糖尿病腎病總發(fā)生率為47.7％。尤其以I 型糖尿病病人為主

4、。若I型糖尿病病程過(guò)20年，10％會(huì)有腎病，最終會(huì)發(fā)展為終末期腎病即尿毒癥。 胰腎聯(lián)合移植（simultaneous pancreas-kidney transplantation，SPK）是臨床治療糖尿病腎病的唯一有效途徑。1966年美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)的Kelly和Lillehei成功實(shí)施了首例胰腎聯(lián)合移植手術(shù)。根椐全美器官分配網(wǎng)絡(luò)(UNOS)和國(guó)際胰腺移植登記中心(IPTR)記錄，胰腺移植的總數(shù)正不斷的增加，從1966年12

5、月至2002年10月，總數(shù)達(dá)18843例，其中絕大多數(shù)在美國(guó)(13951 例)。自1987年到2002年，UNOS報(bào)道的13330個(gè)胰腺移植病例中，其中78％采用SPK。迄今為止，SPK被公認(rèn)為治療I型糖尿病( IDDM)并發(fā)尿毒癥的最理想的方法。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著移植技術(shù)的發(fā)展，以及新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，使得該手術(shù)的安全性和成功率不斷提高。 本課題旨在研究T 細(xì)胞疫苗是否能夠誘導(dǎo)胰腎聯(lián)合移植時(shí)的免疫耐受，為臨床提

6、高胰腎聯(lián)合移植的成功率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。首先制備了T細(xì)胞疫苗并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定。實(shí)驗(yàn)選用近交系A(chǔ)S 大鼠、SD 大鼠和Wistar大鼠，利用AS 大鼠和SD 大鼠分離脾細(xì)胞后免疫Wistar 大鼠，分離Wistar大鼠的脾細(xì)胞。在體外用ConA 將其活化，使其表達(dá)多種活化受體，從而增強(qiáng)其抗原性，然后用絲裂霉素處理，滅活后制成T 細(xì)胞疫苗。實(shí)驗(yàn)表明兩種T 細(xì)胞疫苗免疫Wistar 大鼠后，都能夠誘導(dǎo)脾細(xì)胞對(duì)ConA 誘導(dǎo)的增殖能力低

7、下，表明T 細(xì)胞疫苗免疫后引起一定程度的T 細(xì)胞非特異性免疫功能低下，部分解釋了T 細(xì)胞疫苗作用的抗原非特異性；T 細(xì)胞疫苗能夠誘導(dǎo)針對(duì)同種抗原發(fā)生免疫耐受，該效應(yīng)既具有特異性，也有非特異性效應(yīng)；T 細(xì)胞疫苗能夠誘導(dǎo)外周血T 細(xì)胞發(fā)生凋亡，使CD4/CD8 比值減小。建立穩(wěn)定可靠的胰腎聯(lián)合移植動(dòng)物模型對(duì)于進(jìn)行胰腎聯(lián)合移植的生理及免疫方面的研究具有重要意義。大鼠由于基因型恒定，可利用純系品種建立模型，證明模型穩(wěn)定、可行，再用同種異體大鼠進(jìn)

8、行理論探索。因此大鼠是較理想的胰腎十二指腸聯(lián)合移植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我們?cè)赟TZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠基礎(chǔ)上建立了大鼠胰腎聯(lián)合移植模型，術(shù)后生化指標(biāo)、病理結(jié)果均正常。手術(shù)成功率為76％，為以后的免疫耐受試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。我們建立的大鼠胰腎聯(lián)合移植模型采用了改進(jìn)的血管吻合技術(shù)，大大減少了手術(shù)并發(fā)癥，并縮短了手術(shù)時(shí)間。采用的胰液腸內(nèi)引流術(shù)式更合乎生理，減少了并發(fā)癥的發(fā)生。 利用第一部分和第二部分的工作基礎(chǔ)，制備同種抗原特異性T 細(xì)胞疫苗，接種

9、給胰腎聯(lián)合移植受體大鼠，通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)分組于不同時(shí)點(diǎn)進(jìn)行免疫接種，以觀察特異性免疫耐受的建立及排斥發(fā)生情況。我們用T 細(xì)胞疫苗對(duì)同種異基因胰腎聯(lián)合移植的排斥反應(yīng)進(jìn)行了治療，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了免疫抑制劑FK506作為對(duì)照。研究結(jié)果表明，T 細(xì)胞疫苗可部分抑制CD4 和CD8 細(xì)胞的比值增高，能夠降低移植排斥反應(yīng)時(shí)血清中白細(xì)胞介素-2 和腫瘤壞死因子水平，并且能夠在RNA 水平和蛋白水平下調(diào)選擇素的表達(dá)。根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，我們認(rèn)為T 細(xì)胞疫苗