副溶血性弧菌QS系統(tǒng)核心調(diào)控子OpaR和AphA對(duì)mfp和cpsQ的調(diào)控研究.pdf

1、背景:副溶血性弧菌是一種食源性致病菌，具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，其在形成生物膜過程中，主要受QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)。OpaR和AphA是副溶血性弧菌QS系統(tǒng)的兩個(gè)核心調(diào)控子，在不同的菌密度條件下調(diào)控生物膜的形成。cpsQ和mfp基因座位緊密連鎖，兩者均與細(xì)胞表面特征有關(guān)，其轉(zhuǎn)錄受多個(gè)調(diào)控子的調(diào)控，如cpsQ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受CpsR的調(diào)控和CpsQ自調(diào)控。那么，OpaR和AphA對(duì)cpsQ和mfp是否存在直接調(diào)控關(guān)系呢？還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　目的

2、：深入研究副溶血性弧菌QS系統(tǒng)核心調(diào)控子OpaR和AphA對(duì)生物膜相關(guān)基因cpsQ和mfpA的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：利用自殺載體的方法構(gòu)建副溶血性弧菌opaR和aphA基因的無痕非極性突變株;提取野生株與調(diào)控子基因突變株在特定培養(yǎng)條件下的總RNA，利用引物延伸實(shí)驗(yàn)研究mfpA與cpsQ的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并根據(jù)引物延伸條帶的相對(duì)豐度，判定調(diào)控子蛋白對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系;PCR擴(kuò)增mfpA與cpsQ的整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列，純化回收后，將

3、其直接克隆入pHRB309質(zhì)粒無啟動(dòng)子區(qū)β-半乳糖苷酶基因的上游，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入副溶血性弧菌野生株和調(diào)控子基因突變株中，通過測定二者中β-半乳糖苷酶活性差異，進(jìn)一步驗(yàn)證調(diào)控子對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系;分別擴(kuò)增mfpA與cpsQ的整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列，并表達(dá)純化副溶血弧菌His-OpaR與His-AphA重組蛋白，通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證調(diào)控子蛋白對(duì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)是否具有直接的相互作用;最后通過DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證調(diào)控子蛋白

4、對(duì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)具體相互作用的位點(diǎn)。
　　結(jié)果：AphA低密度表達(dá)，只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)C(-200)，其轉(zhuǎn)錄起始受密度抑制。OpaR高密度表達(dá)，也只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)G(-74)，其轉(zhuǎn)錄具有密度依賴性。低密度條件下:mfpA只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A（-70）（翻譯起始位點(diǎn)為+1），其轉(zhuǎn)錄起始受AphA的抑制;體外實(shí)驗(yàn)表明，AphA能直接結(jié)合到mfpA啟動(dòng)子區(qū)-84和-129之間的堿基序列上。cpsQ也只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)C(-70

5、)，且其轉(zhuǎn)錄起始也同樣受AphA的抑制，但這種抑制是間接的。高密度條件下:mfpA和cpsQ的轉(zhuǎn)錄起始受OpaR的激活，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)均同低密度條件。體外實(shí)驗(yàn)表明，OpaR能直接結(jié)合到mfpA啟動(dòng)子區(qū)-133和-177之間的堿基序列上，卻不能直接與cpsQ結(jié)合，因此其對(duì)mfpA的激活是直接的，而對(duì)cpsQ的激活是間接的。mfpA和cpsQ基因的轉(zhuǎn)錄也是密度依賴性的，均只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，分別為A(-70)和C(-70)。
　　結(jié)