骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷的免疫機理及調控研究.pdf

1、背景與目的:四肢手術如全膝關節(jié)置換術等使用止血帶等可引起骨骼肌缺血再灌注損傷并通過炎癥反應氧化應激等途徑引起遠隔重要器官甚至全身多器官損傷,其中以心血管系統(tǒng)的損傷最為重要。我們前期對骨骼肌缺血再灌注心肌損傷的機制進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)炎細胞在心肌組織的聚集活化、全身及心肌局部炎性細胞因子的激活、過度的氧化應激及氧化-抗氧化體系的失衡、醛固酮的持續(xù)激活是骨骼肌缺血期及再灌注期心肌損傷的重要病理學基礎,但其中的免疫調控機制還不是十分清楚。近來

2、研究發(fā)現(xiàn)以高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box protein1,HMGB1)及Toll樣受體4(Toll-like receptor,TLR4)激活為特征的固有免疫系統(tǒng)激活在心、肺、肝、腎等臟器缺血再灌注損傷中具有重要作用。髄樣分化初極反應基因88(Myeloid differentiation primary-responsegene88,MyD88)是TLR4主要的銜接蛋白,TLR4和MyD88結合后

3、可以激活下游的核因子-kB(NF-kB)信號通路,促發(fā)炎癥反應。而HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信號通路在骨骼肌缺血再灌注致遠隔心肌損傷中的作用還不清楚,也未見研究報道。本研究通過:一、觀察全膝關節(jié)置換術后患者單核細胞和中性粒細胞TLR4表達及血漿炎性細胞因子IL-6的變化,以及手術后細胞免疫、體液免疫及心肌損傷指標TnI的變化,明確全膝關節(jié)置換術致心肌損傷的作用及術后免疫功能的改變。二、觀察HMGB1-TLR4-MyD8

4、8-NF-kB信號通路以及炎性細胞因子IL-6、IL-10、IL-17HMGB1在大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌細胞損傷中的作用,及H2S和螺內酯(Spiron)對該信號通路及炎性細胞因子的調控作用,進一步深入研究骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷的心肌局部免疫調控變化,并尋求有效的干預途徑。同時觀察HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信號通路以及炎性細胞因子IL-6、IL-10、IL-17在大鼠骨骼肌缺血再灌注合并骨折及軟組織創(chuàng)傷后心肌損傷

5、中的作用,對嚴重的肢體復合傷造成心肌損傷的免疫機理進行初步探討。
　　方法:第一部分:雙膝關節(jié)置換(術中須用止血帶)手術病人15例,觀察時間點:術前、術后4h、術后12h,采用自身對照研究。觀察患者手術前后血漿肌鈣蛋白-I(TnI)及IL-6、IgG、IgM、IgA水平的變化,利用流式細胞學技術觀察患者手術前后淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及單核細胞和中性粒細胞TLR4表達的變化。第二部分:雄性Wistar大鼠46只,應

6、用止血帶結扎構建大鼠雙下肢缺血再灌注模型,隨機分為6組,除IR+創(chuàng)傷組有6只大鼠外,其余各組均有8只大鼠:(1)C組:正常對照組。(2)IR組:缺血4小時再灌注4小時組。(3)IR+創(chuàng)傷組:大鼠雙下肢結扎后,制造骨骼肌缺血再灌注加右股骨骨折及軟組織損傷的復合創(chuàng)傷模型。骨骼肌缺血時間和再灌注時間同IR組。(4)IR+NaHS組:結扎前及再灌注前腹腔注射H2S供體硫氫化鈉(NaHS)0.78mg/kg。(5)IR+PPG組:結扎前及再灌注前

7、腹腔注射CSE酶抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)60mg/kg。(6)IR+Spiron組:結扎前每天給予Spiron(20mg/kg)灌胃持續(xù)6天。觀察各組大鼠心肌細胞凋亡的改變及血漿心肌酶TnI的變化,觀察大鼠血漿及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平的變化,以WesternBlot方法檢測大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κBp65、P-NF-κBp65蛋白含量,以

8、RealtimePCR方法檢測大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達,以免疫組化法觀察大鼠心肌TLR4、P-NF-κBp65的表達。
　　結果:第一部分:全膝關節(jié)置換術后4小時血漿單核細胞及中性粒細胞表面TLR4表達、IL-6、TnI水平較術前明顯上升(P<0.05),炎性細胞因子IL-6水平術后12小時較術后4小時繼續(xù)顯著上升(P<0.05),血漿單核細胞及中性粒細胞表面TLR4表達及TnI水平術后12小時持續(xù)處于

9、高水平,較術后4小時沒有繼續(xù)上升(P>0.05)。全膝關節(jié)置換術后12小時T淋巴細胞亞群CD4+的數(shù)量及CD4+/CD8+細胞比值明顯下降(P<0.05)。全膝關節(jié)置換術后IgG、IgM、IgA水平沒有明顯變化(P>0.05)。第二部分:與正常對照組比較,骨骼肌缺血再灌注組大鼠血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù)明顯升高,血漿及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平顯著上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp6

10、5蛋白含量明顯上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達顯著上調(allP<0.05)。與骨骼肌缺血再灌注組比較,H2S和螺內酯干預可以明顯降低血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù),降低血漿及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平,升高血漿及心肌IL-10水平,使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明顯下降,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達顯著下調(allP<0.05);PPG干預和缺

11、血再灌注合并創(chuàng)傷可以使血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù)繼續(xù)升高,血漿及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平進一步升高,使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明顯上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達顯著上調(allP<0.05),對血漿及心肌IL-10水平沒有顯著影響(P>0.05)。各組大鼠NF-κBp65蛋白表達沒有顯著差異(P>0.05)。免疫組化提示缺血再灌注組大鼠心肌細胞可見較多T

12、LR4、P-NF-κBp65抗體陽性棕色染色顆粒,H2S和螺內酯干預組心肌細胞棕色染色顆粒明顯減少,PPG干預和缺血再灌注合并骨創(chuàng)傷組棕色陽性染色顆粒進一步增多。
　　結論:1,全膝關節(jié)置換術可造成心肌損傷,并激活機體的固有免疫及炎癥反應,同時抑制細胞免疫功能。2、大鼠骨骼肌缺血再灌注可以上調全身和心肌局部的內源性危險分子HMGB1,激活心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信號通路,使血漿及心肌局部的前炎癥細胞因子IL-

13、6、IL-17及抗炎因子IL-10大量釋放,從而加重心肌細胞凋亡和損傷。3、硫化氫供體NaHS以及醛固酮特異性拮抗劑螺內酯均可以通過降低大鼠骨骼肌缺血再灌注后全身和心肌局部的內源性危險分子HMGB1的水平,抑制心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信號通路激活,下調血漿及心肌的前炎癥細胞因子IL-6、IL-17水平,增加血漿和心肌的抗炎細胞因子IL-10的水平,從而減輕骨骼肌缺血再灌注后心肌的炎癥反應及心肌細胞凋亡和損傷。證明醛