旋毛蟲谷氨酸脫羧酶TsGAD的表達(dá)和定位及不同pH對(duì)其影響的研究.pdf

1、旋毛蟲病是由旋毛形線蟲（Trichinella spiralis）引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患線蟲病。宿主通過(guò)攝入含有感染性肌幼蟲的肉而致病，富含旋毛蟲包囊的肉被哺乳動(dòng)物吞食后，在胃酸的作用下，肌肉組織在胃內(nèi)消化，感染性肌幼蟲被釋放出來(lái)。旋毛蟲作為一種食源性病原體，其生活史決定了旋毛蟲肌幼蟲需經(jīng)過(guò)哺乳動(dòng)物的胃這一極酸性環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致宿主發(fā)病，但其是否存在與大腸桿菌相似的抗酸機(jī)制，現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。已有研究結(jié)果證實(shí)，谷氨酸在旋毛蟲體內(nèi)，尤其是肌

2、幼蟲含量很高，并且旋毛蟲谷氨酸脫羧酶（GAD）基因序列已發(fā)表可查，所以推測(cè)旋毛蟲肌幼蟲中也可能具有類似的谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)。
　　本文根據(jù)GenBank上TsGAD的基因編碼序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，提取旋毛蟲肌幼蟲總RNA，采用RT-PCR方法得到cDNA后，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)DH5α，經(jīng)過(guò)PCR和HindⅢ、BamHⅠ雙酶切、測(cè)序后，將鑒定正確的

3、目的片段與表達(dá)載體pET-30a(+)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，采用1mol/LIPTG，于37℃誘導(dǎo)5h是表達(dá)效果最為理想的條件，經(jīng)SDS-PAGE分析目的蛋白出現(xiàn)于57kDa左右，目的蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為57KDa，與預(yù)測(cè)的理論值相符。
　　實(shí)驗(yàn)采用比色法測(cè)定TsGAD重組蛋白活性，結(jié)果顯示TsGAD具有酶活性，活性大小為1.5U，說(shuō)明通過(guò)

4、復(fù)性得到正確折疊結(jié)構(gòu)的TsGAD蛋白。將純化的重組蛋白多位點(diǎn)免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，獲得免疫多抗血清，用Western Blot方法對(duì)免疫原性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，多克隆抗血清作為抗體可以識(shí)別重組蛋白并與之結(jié)合。利用間接ELISA方法檢測(cè)獲得的多抗效價(jià)，結(jié)果表明，獲得的多抗效價(jià)達(dá)到1∶65536，該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，并且特異性高;免疫熒光定位試驗(yàn)結(jié)果證明，TsGAD分布予旋毛蟲肌幼蟲蟲體體表。
　　根據(jù)

5、GenBank中發(fā)表的旋毛蟲的TsGAD和TsGAPDH基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光引物，建立熒光定量PCR檢測(cè)方法。利用建立的TsGAD實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，將pH設(shè)置4個(gè)梯度，分別為pH2.5、pH4.0、pH6.6和pH9.0，為了檢測(cè)不同pH條件下培養(yǎng)的旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，隨著pH值的降低，TsGAD mRNA表達(dá)量逐漸升高，在pH2.5時(shí)TsGAD mRNA表達(dá)量顯著高于pH4.0、pH6.6