Ti m-3 抑制抗感染免疫的分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　近些年來，各種病毒性疾病如流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、埃博拉病毒感染等的發(fā)病呈日益上升的趨勢，嚴重威脅人們的生命健康，帶給家庭和社會沉重的負擔。據統計，人和動物約有60％的疾病是由病毒感染引起的，其中流感病毒流行性強、具周期性、有些可人獸共患，因此流感病毒極具危害性。在應對流感等病毒感染中，宿主通過產生多種免疫效應分子如干擾素和抗體等對抗感染，其中Ⅰ型干擾素（TypeⅠInterferon）作為固有免疫應答

2、的重要效應分子，在早期抗病毒免疫中占有尤為重要的作用。
　?、裥透蓴_素及其他免疫效應分子在抗病毒免疫中具有重要作用，生理及病理情況下Ⅰ型干擾素的調控機制如何，能否從中尋找新的抗病毒治療策略等是本領域研究者普遍關注的課題。我們前期研究關注固有免疫調控機制的研究，基于芯片技術發(fā)現抑制性免疫檢查點分子T細胞免疫球蛋白及粘蛋白3（T-cell-Ig-muci n-3，Tim-3）負性調控巨噬細胞中Ⅰ型干擾素相關分子如RIG-I（retin

3、oic acid-i nducible gene I）、IFI44（Interferon inducible factor44）、ISG15（Interferon sti mulated gene15）等的表達?；诖?，Tim-3是否通過抑制Ⅰ型干擾素參與抗感染免疫的調控，其臨床意義如何成為我們重點關注的課題。
　　Tim-3是一最初發(fā)現于活化的T效應細胞上的免疫細胞活性調控分子，按照結構來說屬于Tim家族成員。Tim-3與其配體

4、半乳凝素9（Galectin-9，Gal-9）結合后能夠誘導細胞凋亡，或者通過其他機制抑制T效應細胞（Th1/Th17/Tc1）的功能，維持T細胞的穩(wěn)態(tài)。Ti m-3表達異常與多種免疫相關疾病如自身免疫病、腫瘤及病毒感染的關系越來越受到人們的重視，被認為是繼CTLA-4、PD-1之后一種新的免疫治療靶點。
　　除了表達在活化的T細胞上外，Tim-3還表達在人和鼠的固有免疫細胞上。Tim-3信號對固有免疫反應的調控機制目前尚不十分清

5、楚，此方面研究近來引起人們的普遍關注。鑒于巨噬細胞等固有免疫細胞在抗病毒感染中處于一線防御地位，在感染情況下Tim-3信號如何調控巨噬細胞的功能，如何通過調控固有免疫反應影響抗病毒感染的進程是非常值得探討的課題。
　　我們實驗室較早關注Tim-3信號對固有免疫的調控作用。已有研究顯示Tim-3在膿毒血癥（Sepsis）中的功能或表達異常與體內單核巨噬細胞的異常活化有關，隨后證實Tim-3可以通過抑制LPS誘導的NF-kB活化等機制

6、負性調控巨噬細胞的功能，這提示Ti m-3信號對巨噬細胞的免疫功能負性調控作用，但具體的分子機制尚需要進一步探討。我們的研究提示Tim-3有可能是巨噬細胞潛在的調控靶點。
　　Tim-3分子胞內段較短，不存在像其他負性免疫調控分子（如PD-1）一樣的抑制性基序，因此目前對于該分子發(fā)揮抑制作用的分子機制研究存在一定的困難。近年來哈佛大學醫(yī)學院的Kuchroo教授的課題組一直在關注Tim-3信號在T細胞穩(wěn)態(tài)調控中的作用，他們發(fā)現Bat

7、3（HLA-B-associated transcript3）和CEACAM1（carcinoembryonic antigen celladhesion molecule1）參與了Tim-3信號對T細胞的負性調控過程，但該研究聚焦在T細胞。Ti m-3信號如何抑制固有免疫細胞、其胞內的信號通路是迫切需要回答的課題。
　　基于我們前期的研究基礎，Tim-3信號是否通過抑制固有免疫應答調控機體的抗感染免疫進程，如果是，其分子機制如何

8、成為本論文要重點回答的課題。
　　目的：
　　1、以H1N1（PR8）病毒感染為模型，明確Tim-3信號對H1N1病毒感染的影響；
　　2、在H1N1病毒感染小鼠體內以及在巨噬細胞中明確Tim-3信號對Ⅰ型干擾素及其相關分子的調控作用；
　　3、重點闡明Tim-3信號調控巨噬細胞Ⅰ型干擾素信號通路的分子機制。
　　方法與結果：
　　1、Tim-3信號負性調控體內外抗H1N1免疫反應：
　　1.1

9、 Tim-3信號負性調控體內抗H1N1免疫反應，加重組織損傷。我們建立小鼠的早期H1N1感染模型，發(fā)現與野生型（WT）小鼠相比，Tim-3轉基因（Tim-3 TG）小鼠H1N1滴度升高，肺病理損傷加重；在感染H1N1的WT小鼠體內注射可溶性Tim-3蛋白（soluble Tim-3,sTim-3）阻斷Tim-3信號后，小鼠H1N1滴度降低，肺病理損傷改善，表明Tim-3信號對體內抗H1N1感染發(fā)揮抑制作用。
　　1.2 Tim-3

10、信號抑制重要的固有免疫細胞——巨噬細胞的抗H1N1病毒免疫反應。我們用H1N1病毒感染巨噬細胞，巨噬細胞中Tim-3表達水平升高并伴隨高載量H1N1病毒；瞬轉Tim-3質粒以過表達Tim-3，巨噬細胞病毒載量升高；阻斷Tim-3信號后巨噬細胞病毒載量下降。
　　2、體外及體內實驗發(fā)現Tim-3信號抑制Ⅰ型干擾素及其相關分子的表達：
　　為了初步探討Tim-3信號抑制抗H1N1感染免疫的機制，我們：
　　1）通過芯片數據

11、分析了Tim-3信號影響免疫功能的可能機制，發(fā)現Tim-3信號抑制巨噬細胞中Ⅰ型干擾素相關分子的表達；
　　2）在體內實驗中，分析了干預Tim-3信號對H1N1感染小鼠體內Ⅰ型干擾素及其相關分子表達的影響，結果發(fā)現Tim-3信號抑制體內Ⅰ型干擾素及其相關分子的表達；
　　3）在體外試驗中，通過阻斷Tim-3信號，沉默以及過表達Tim-3的方法，并通過Q-PCR、Western blot、ELISA等技術驗證了Tim-3信號對

12、Ⅰ型干擾素相關分子表達的影響，結果發(fā)現Tim-3信號抑制巨噬細胞中Ⅰ型干擾素的表達，同時對RIG-I、IFI44、ISG15等分子發(fā)揮抑制作用。
　　3、Tim-3信號抑制Ⅰ型干擾素及其相關分子表達的分子機制探討
　　鑒于RIG-I在感應H1N1病毒以及在調控Ⅰ型干擾素表達中的關鍵作用，本研究重點是“Tim-3信號通過調控RIG-I的表達及功能來調控Ⅰ型干擾素及相關分子的表達”，并對這一研究假設進行了驗證。
　　3.1

13、 Tim-3通過轉錄因子STAT1抑制RIG-I在巨噬細胞的表達。我們在Tim-3沉默體系發(fā)現，敲低Tim-3后RIG-I的轉錄水平顯著上調，而STAT1的抑制劑fludarabine顯著下調RIG-I的轉錄水平和蛋白水平；我們還分析了RIG-I的啟動子序列并將 RIG-I啟動子區(qū)整合到 PGL3熒光素酶報告基因載體上，構建了STAT1和Tim-3真核表達質粒，在雙熒光素酶報告體系中發(fā)現STAT1會顯著提升RIG-I轉錄水平，而Tim-

14、3過表達抑制由STAT1所激活的RIG-I轉錄。該實驗結果提示Tim-3抑制STAT1對RIG-I的轉錄激活。
　　3.2 Tim-3在轉錄后水平調控RIG-I的泛素化。
　　泛素化修飾是調控RIG-I功能的一種重要方式，我們探討了Tim-3是否以及如何參與RIG-I泛素化的調控。
　　3.2.1 Tim-3與RIG-I之間存在相互作用和共定位。我們利用免疫共沉淀（Co-IP）的方法檢測，內源和外源表達的Tim-3/R

15、IG-I之間都存在相互作用；共轉RIG-I/Tim-3熒光載體并在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現兩者之間存在共定位。
　　3.2.2Tim-3信號上調RIG-I K48連接的泛素化（RIG-I在蛋白酶體降解的標記），下調K63連接的泛素化（RIG-I活化的標記）。我們通過IP的方法檢測了在有無Tim-3表達的情況下RIG-I泛素化水平的變化，發(fā)現Tim-3過表達會促進RIG-I K48連接的泛素化，并進而促進RIG-I的降解；Tim-

16、3過表達抑制RIG-IK63連接的泛素化。而Tim-3胞內段缺失突變后，上述兩種調節(jié)泛素化的效應消失。
　　3.2.3 Tim-3與A20共同參與RIG-I的泛素化調控。首先，我們進一步通過Co-IP和Confocal的實驗發(fā)現，Tim-3與A20、RIG-I這兩個分子之間同時存在相互作用和共定位；A20參與Tim-3對RIG-I K48和K63這兩種形式的泛素化調控，其作用結果是促進RIG-I在蛋白酶體的降解，抑制RIG-I信號

17、的活化。
　　3.2.4 Tim-3通過 A20/RIG-I/IRF-7(IRF-3)軸調節(jié)Ⅰ型干擾素表達。我們在Tim-3信號阻斷體系，Tim-3基因沉默體系和 Tim-3過表達體系中發(fā)現，Tim-3與A20聯合，通過調控RIG-I K48/K63連接的泛素化來促進RIG-I降解并抑制RIG-I的活化并進而抑制IRF-3/7的磷酸化。提示存在Tim-3/A20-RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干擾素調節(jié)軸。
　　結論：

18、r>　　本研究重點探討了Tim-3信號影響抗病毒免疫的分子機制，本研究的創(chuàng)新點在于：
　　1）Tim-3在病毒性感染中的研究中多關注T細胞，我們重點闡明了病毒感染過程中Tim-3抑制固有免疫功能的分子機制；
　　2）我們闡明了Tim-3對RIG-I這一關鍵病毒受體的負性調控機制，發(fā)現了Tim-3/A20- RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干擾素調節(jié)軸的存在，為進一步了解這一分子的調控功能提供了新的實驗依據。
　　本研究