苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表達及特性研究.pdf

1、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOX，EC1.1.3.4）是生物體體內(nèi)的一類重要的氧化還原酶類，其具有專一性的特點，可以針對性的將β-D-葡萄糖氧化分解為葡萄糖酸以及過氧化氫，而這兩個分解物又將繼續(xù)參加其它重要的代謝途徑發(fā)揮作用。因此GOX在植物、動物和微生物體內(nèi)都是不可缺少的一類功能酶。
　　苜蓿夜蛾(Heliothis viriplaca)是鱗翅目夜蛾科昆蟲，是比較常見的大豆害蟲之一。其主要蠶食植物葉片和幼嫩的

2、組織，并且鉆入和蛀食豆莢來使大豆品質(zhì)變差，產(chǎn)量降低。除了取食大豆以外其對于苜蓿、棉花、亞麻等作物都具有極大的危害性。
　　本試驗以苜蓿夜蛾為試驗材料來進行總RNA的提取，并利用反轉(zhuǎn)錄PCR和cDNA末端快速擴增技術(shù)，克隆得到苜蓿夜蛾GOX基因全長eDNA序列(GenBank的登錄號為KT907054)。將苜蓿夜蛾GOX基因連接原核表達載體pET-21b并在大腸桿菌內(nèi)進行表達，并將表達的蛋白用Ni-NTA親和層析柱純化，將純化后的蛋

3、白利用梯度透析法進行復性，最后以葡萄糖為底物對表達出的GOX進行活性測定。用濾紙片抑菌圈試驗法研究葡萄糖氧化酶對細菌的抑制作用。利用Real-time PCR技術(shù)對基因表達量進行檢測，分別在不同組織（前腸、中腸、后腸、馬氏管、唾腺、脂肪體）中GOX基因的表達差異性，在不同濃度葡萄糖即濃度分別為0.01％、0.1％、1％、10％誘導下GOX基因的表達差異性和分別饑餓3h、6h、12h、24 h、48 h條件下GOX基因的表達差異情況。并針

4、對HvGOX基因進行了RNA干擾的初步研究。主要試驗結(jié)果如下:
　　(1)苜蓿夜蛾GOX基因的cDNA序列有2154bp，其中包括含有1824bp的開放閱讀框，編碼由607個氨基酸組成的多肽，其分子量為67.04kDa，等電點為5.13。將該序列命名為HvGOX,在GenBank的登錄號為KT907054。HvGOX氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲GOX氨基酸序列同源高達60％～89％之間，苜蓿夜蛾與棉鈴蟲Helicoverpa arm

5、igera(ACC94296)和谷實夜蛾Helicoverpazea(ACJ71598)相似性為89％，與甜菜夜蛾Spodoptera exigua(ADL38963)相似性76％。由此證明，本試驗克隆的基因為苜蓿夜蛾的一條新的葡萄糖氧化酶基因。
　　(2)將本試驗得到的HvGOX基因與原核表達載體pET-21b連接，并將重組子轉(zhuǎn)入到BL21感受態(tài)細胞里，利用誘導劑IPTG，使外源蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，

6、表達蛋白與預測蛋白的分子量相符。因表達的蛋白為包涵體蛋白，需要經(jīng)過變性，純化和復性來獲得相對較純的有活性的蛋白，將該蛋白與購買的商品化GOX分別以葡萄糖為底物進行酶活測定，結(jié)果表明，經(jīng)原核表達的蛋白活性較低，其活性為商品化蛋白的1/16倍。再將表達蛋白與商品蛋白在相同濃度下分別進行抑菌圈試驗，結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶有抑菌作用但由于原核表達的蛋白活性較低，抑菌作用不明顯，而同濃度下的商品蛋白可見較明顯的抑菌效果。
　　(3)根據(jù)熒光

7、定量PCR的檢測表明:葡萄糖氧化酶基因在苜蓿夜蛾的不同組織中均有mRNA水平的特異表達，其中在唾腺中的表達量最高，與其他組織差異性顯著。用濃度為0.01％、0.1％、1％和10％四種濃度的葡萄糖溶液浸泡的大豆葉片喂食幼蟲，幼蟲體內(nèi)的葡萄糖氧化酶基因的表達均被誘導，且在葡萄糖濃度為10％的情況下GOX的表達量為最高，與其他三個濃度差異性顯著。將苜蓿夜蛾5齡幼蟲饑餓處理3、6、12、24、48 h，結(jié)果表明饑餓12h時葡萄糖氧化酶基因的表達