小金海棠檸檬酸合成酶基因MxCS2的克隆與功能分析.pdf

1、本研究以鐵高效基因型蘋果砧木小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)為試材，以從中克隆得到一個(gè)新的檸檬酸合成酶基因(CS)為研究對(duì)象，利用已公布的蘋果金冠全基因組序列圖譜的檸檬酸合成酶基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，用Trizol法提取小金海棠的RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，通過巢式PCR擴(kuò)增的方法獲得小金海棠CS基因片段，區(qū)別于之前從小金海棠中克隆得到的MxCS1基因，將該基因命名

2、為MxCS2。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)MxCS2基因的開放閱讀框全長為891bp，利用DNAMAN5.2軟件將測(cè)序獲得的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，推測(cè)MxCS2基因負(fù)責(zé)編碼一個(gè)由296個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)其分子量約為33.2kDa，理論等電點(diǎn)為7.79。對(duì)MxCS2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域包含有三個(gè)α螺旋和三個(gè)無規(guī)則卷曲，亞細(xì)胞定位顯示MxCS2蛋白定位于線粒體和細(xì)胞質(zhì)膜上。利用NCBI網(wǎng)站中的blast功能進(jìn)行MxCS2

3、基因和其他物種的CS基因的氨基酸和核苷酸相似性分析，得到同源進(jìn)化樹，MxCS2與MxCS1和PpCS1（桃）聚合在一簇，AtCS4（擬南芥），DcCS（胡蘿卜），NtCS（煙草）聚合在另一簇，OsCS（水稻）單獨(dú)為第三簇。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示在正常供鐵時(shí)，MxCS2在葉中、根部和韌皮部均表達(dá)，在木質(zhì)部中幾乎不表達(dá)，其表達(dá)情況為幼葉表達(dá)量最高，其次是真葉、根部、韌皮部，表達(dá)量最低的是木質(zhì)部。說明MxCS2基因主要在生命活

4、動(dòng)活躍的器官中發(fā)揮作用。在低鐵處理和IAA處理時(shí)，小金海棠的幼葉、韌皮部和根部中的MxCS2基因的表達(dá)量，隨著處理時(shí)間的延長，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在處理12h時(shí)達(dá)到最大值，在處理24h后緩慢降低;而在高鐵處理過程中這些部位的MxCS2基因的表達(dá)隨著處理時(shí)間的延長有較低程度的減弱。真葉中MxCS2基因在鐵脅迫條件下的表達(dá)水平與上述部位相反，而在IAA處理下與上述部位具有相同趨勢(shì)。此外，ABA處理對(duì)MxCS2基因的表達(dá)水平影響并不顯著。

5、
　　在轉(zhuǎn)入MxCS2基因的擬南芥植株T3代鑒定試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在正常供鐵時(shí)，轉(zhuǎn)基因型擬南芥植株和野生型植株的表現(xiàn)型都正常;低鐵處理時(shí)，野生型植株有明顯的黃化現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因型植株沒有出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象;高鐵處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因型植株的表現(xiàn)型要好于野生型。說明在缺鐵和過量鐵的情況下轉(zhuǎn)基因型擬南芥比野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鐵脅迫能力。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鐵吸收相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定，得到如下結(jié)果:在高鐵和低鐵環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因型植株的鮮重與野生型植株相比，分

6、別為野生型的1.9倍和2.1倍。測(cè)得在高鐵和低鐵環(huán)境下轉(zhuǎn)基因型植株的根長分別為野生型的1.4倍和1.9倍。轉(zhuǎn)基因型植株幼苗中的葉綠素含量比野生型高，特別是處于低鐵和高鐵脅迫下，野生型植株的葉子有更多枯萎和黃化現(xiàn)象，與葉綠素含量情況一致。在高鐵和低鐵環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因型植株的CS活性分別是野生型的3.1倍和3.8倍。在高鐵、正常鐵和低鐵環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因型植株的鐵濃度分別是野生型植株的1.3倍、1.1倍、1.8倍。在高鐵和低鐵環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因型植株